ДИНАМИКА НЕКОТОРЫХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕНИЯ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ У СОРТОВ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К РНУТОГНТНОВЛ

В.              Е. СОКОЛОВА

Институт биохимии им. А. Н. Баха АН СССР

Среди фенольных соединений, встречающихся в растениях и, б частности, в картофеле, особое внимание исследователей привлекают хлорогеновая и кофейная кислоты.

К таким работам, в частности, относятся исследования Джонсона и Шэлла [1, 2], на основании которых авторы пришли к выводу, что устойчивость картофеля к парше (Streplomyzes scabies) определяется содержанием в клубнях хлорогеновой кислоты, причем решающим фактором является концентрация этого соединения вокруг чечевичек, которые служат естественным входом для патогена.

Позднее теми же исследователями было обнаружено [3], что кожура клубней картофеля более устойчивого к парше сорта Бэрбанк по сравнению с кожурой неустойчивого сорта Триумф отличается большим содержанием ортодифенолов и среди последних — хлорогеновой кислоты. Однако это различие между сортами наблюдалось только на ранних фазах роста и сглаживалось в период созревания клубней, а в дальнейшем при хранении.

Следует отметить, что заключение о более или менее высоком содержании хлорогеновой кислоты и других ортодифенолов было сделано авторами на основании цветной реакции с 2%-ным водным раствором хлорного железа, несколько капель которого помещалось на мацерированную острым скальпелем поверхность клубней. При этом у высокоустойчивых сортов появлялась зеленая окраска, тогда как у неустохиивых окраска была светло-зеленой или совсем отсутствовала.

Поскольку реакция с хлорным железом является общей для ряда фенольных соединений, содержащихся в перидерме клубней, в частности и для кофейной кислоты, вряд ли можно согласиться с утверждением авторов относительно решающего значения для устойчивости клубней высокого содержания именно хлорогеновой кислоты, тем более что сама хлорогеновая кислота отнюдь не отличается высокой токсичностью по отношению к фитопатогенам. Данные, полученные налги при изучении действия хлорогеновой кислоты на рост мицелия Ph. infestans [4], с полной очевидностью показали, что это соединение не только пе подавляет, но значительно стимулирует рост патогена.

Возможно, что в опытах Джонсона и Шэлла большая устойчивость сорта Бэрбапк определялась не столько действием самой хлорогеновой кислоты, сколько продуктами ее окислительных превращений, в частности кофейной кислотой. Как показали наши исследования, это соединение обладает свойством значительно подавлять рост мицелия Ph. infestans [5].

Ченг и Хэннинг [6], также работавшие со здоровым картофелем, установили, что из всех фенольных соединений только одна хлорогеновая кислота присутствует в доступных определению количествах во всех трех типах исследованных ими тканей клубней картофеля — в эпидермисе, субэпидермальном слое и в сердцевине. В эпидермисе, кроме того, была обнаружена кофейная кислота. По данным этих исследователей, основание клубня отличается несколько большим содержанием фенольных соединений по сравнению с верхушкой.

С другой стороны, Рубин и Аксенова [7], проводившие работу на клубиях двух сортов картофеля — устойчивом к Ph. infestans Московским и поражаемом Ранняя Роза, — обнаружили, что содержание хлорогеновой кислоты в основании клубней устойчивого сорта составляет 55% от содержания ее в верхушке. В поражаемом сорте доля хлорогеновой кислоты, приходившаяся иа основание, была значительно выше и составляла 73% от содержания этого депсида в верхушке.

Довольно подробно изучалось распределение хлорогеновой кислоты по отдельным органам растения картофеля Прокошевым и Барановой [8].

Прокошев и Баранова проводили также систематические определения содержания хлорогеновой кислоты в период хранения в клубнях двух сортов — Лорх и Берлиханген — и пришли к вы- воду, что содержание этой кислоты с октября по май остается постоянным [8].

Определением хлорогеновой и кофейной кислот в клубнях сорока сортов картофеля, различающихся по устойчивости к Strep- tomyzes scabies, занимались Вольфганг и Хоффман [10] и обнаружили эти соединения в покровных тканях всех исследованных сортов. В пяти из них содержание хлорогеновой кислоты в мякоти клубней колебалось в зависимости от сорта и времени отбора пробы в пределах 0,47—2,91 мг%. Никакой связи между количеством кислот и устойчивостью клубней к поражению паршой при этом установлено не было.

Банхер и Хёльци [И], использовавшие для установления локализации хлорогеновой и кофейной кислот в тканях клубня картофеля микрохимические реакции и свечение в ультрафиолете, пришли к выводу, что в здоровых клубнях хлорогеновая кислота образуется в основном в периферийном слое; в крахмалсодержащей паренхиме она практически отсутствует. Кофейная кислота была обнаружена ими только в периферийном слое.

Эти исследователи высказали предположение, что присутствие хлорогеновой и кофейной кислот в тканях клубней зависит от наличия кислорода и, возможно, связано с высоким содержанием тирозина.

К аналогичному выводу пришли Цукер и Леви [12], по мнению которых внутренним тканям клубней картофеля свойственна способность синтезировать хлорогеновую кислоту.

Исследованиями Пашкаря [13] было установлено, что количество хлорогеновой кислоты в кожуре молодых клубеньков картофеля выше, чем кофейной. По мере роста клубпей эта разница сглаживается, а в кожуре клубней, поступающих на хранение, содержапие кофейной кислоты значительно выше, чем хлорогеновой.

Наши определения, проводившиеся на клубнях трех сортов картофеля (Московский, Любимец и Приекульский), показали [14], что хлорогеновая кислота находится во всех тканях клубня, включая н сердцевину. Однако содержание ее значительно снижается от периферии к центру клубня.

Как можно видеть из приведенных данных, несмотря на то внимание, которое уделялось исследователями хлорогеновой и кофейной кислотам и, в частности, роли этих соединений как фактора, предупреждающего внедрение паразита, до настоящего времени отсутствуют работы, посвященные систематическому изучению превращений этих соединений как в ходе вегетации, так и в период хранения. Между тем такие исследования могли бы помочь разобраться в системе защитных реакций растений по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, в частности к Ph. infestans.

Как уже указывалось выше, хлорогеновая и кофейная кислоты совершенно по-разному действуют на рост этого патогена. В то время как хлорогеновая кислота стимулирует рост мицелии фитофторы, кофейная значительно подавляет его.

Аналогичные наблюдения были сделаны и при изучении действия этих соединений на прорастание спор и интенсивность роста другого патогена — Fusarium solani [15]. В этом случае хлорогеновая кислота если ие стимулировала, то и не подавляла рост гиф фузариума, тогда как кофейная в значительной степени снижала количество проросших спор и интенсивность роста гиф.

Занимаясь изучением биохимической природы устойчивости картофеля к фитофторе, мы считали необходимым проследить на протяжении периода хранения за изменениями содержания хлорогеновой и кофейной кислот в клубнях картофеля на сортах, различающихся по устойчивости к Ph.

В ходе хранения определялось содержание хлорогеновой и кофейной кислот в различных тканях клубня картофеля: в сухом эпидермисе, субэпидермальном слое, крахмалсодержащей паренхиме и в сердцевине клубней. Первые пробы поступали на анализ при закладке на хранение, последующие — в декабре, марте н мае.

Одновременно с пробами, предназначенными для исследований, закладывались на хранение аналогичные, предварительно взвешенные пробы, вес которых проверялся каждый очередной срок анализа. Результаты этих взвешиваний в дальнейшем должны были использоваться для приведения полученных данных к первоначальному весу.

Каждая из заложенных на хранение проб составлялась из 25 клубней разного размера таким образом, чтобы пробы были совершенно идентичными.

При поступлении на очередной анализ пробу, по возможности быстро, разделяли на соответствующие ткани, которые немедленно фиксировали кипящим метанолом при кипячении на водяной бане в течение 5 мин. Это было необходимо для подавления деятельности полифенолоксидазы клубней картофеля. После фиксации пробы экстрагировали в приборе Сокслета метанолом в течение 36 час. Полученные экстракты упаривали досуха под вакуумом, после чего осадки растворяли в таком количестве .миллилитров этанола, которое соответствовало количеству граммов навески исходного материала. При такой концентрации рабочих растворов картина, получаемая в дальнейшем при хромато

графическом разделении экстрактов, приближалась к той. которая существовала в живых тканях исследуемых клубней.

Полученные экстракты подвергали хроматографическому разделению с помощью бумажной хроматографии [бумага ленинградская медленная; растворитель: н-бутанол—уксусная кислота (ледяная)—вода, 4:1:5, органическая фаза; хроматограмма нисходящая]. В качестве свидетелей наносили хлорогеновую и кофейную кислоты.

По окончании разделения на хроматограммах фиксировали положение флуоресцирующих соединений, обнаруженных прн просмотре в ультрафиолете с помощью ультрахемископа УБ-1. Одновременно отмечали оттенок и интенсивность свечения каждого соединения.

В дальнейшем измеряли площадь, занимаемую на хроматограмме каждым из соединений.

В табл. 1 и 2 приведены величины площадей пятен, полученных при хроматографическом разделении соединений, содержащихся в экстрактах из различных тканей клубней сравниваемых сортов.

В табл. 3 и 4 дается характеристика интенсивности и оттенка свечения тех же соединений.

Мы считаем необходимым привести эти данные, поскольку они дают представление об относительном содержании обнаруженных соединений в различных тканях клубня п об их динамике в ходе хранения. Аналогичные хроматограммы опрыскивали 2%-ным раствором хлорного железа. Реакция с хлорным железом подтвердила фенольную природу обнаруженных при хроматографировании соединений.

Для количественного определения святящиеся пятна хлоро- геновой и кофейной кислот вырезали пз хроматограмм, элюировали при встряхивании 80%-пым этанолом, после чего содержание этих соединений в экстрактах определяли па спектрофотометре СФ-4 при длине волны 324 ммк для хлорогеновой кислоты и 290 ммк для кофейной.

При поступлении очередной пробы клубней картофеля на анализ вторую такую же пробу заражали Ph. infestans (раса 0). В образовавшемся в ответ на заражение некрозе у устойчивого сорта и в загнившей ткани у поражаемого определяли содержание хлорогеновой н кофейной кислот, выделенных из экстрактов исследуемых тканей также с помощью бумажной хроматографии.

Как можно видеть из табл. 1 — 4 наиболее высоким содержанием фенольных соединений как в устойчивом сорте Любимец, так и в поражаемом Прпекульском отличаются покровные ткани — сухой эпидермис и субэпидермальнып слой. Однако наибольшее качественное разнообразие этих соединений было обнаружено в сердцевине клубней сорта Любимец, где содержалось

Площадь пятен (.м.м2) фенольных соединений, обнаруженных при картофеля сорта Любимец в разные сроки хранения

* Я/ свидетелей: хлорогеновая кислота — 0,73—0,75; кофейная кислота—0,82—0,83.

Таблица 2

Площадь пятен (мм2) фенольных соединений, обнаруженных при картофеля сорта Приекульский в разные сроки хранения

* свидетелей: хлорогеновая кислота — 0,73—0,75; кофейная кислота — 0,82—0,83.

хроматографическом разделении экстрактов из различных тканей клубней

О Бпохнлшчесміе основы защиты растений

12У

Окраска и интенсивность свечения в ультрафиолете фенольных соеди из различных тканей клубней картофеля сорта Любимец в разные сроки

* Ну свидетелей: хлорогеновая кислота — 0,74; кофейная кислота — 0 83.

до двенадцати соединений; в сухом эпидермисе клубней того же сорта число их не превышало девяти.

Следует отметить, что для покровных тканей клубней обоих сортов характерно более высокое содержание соединений, располагающихся в нижней части хроматограммы (табл. 1, 2), т. е. соединений с большими значениями 7?/ от 0,67—0,70 до 0,82— 0,83, площадь пятен которых колеблется от 500 до 1900 мм2. Исключением является только соединение с 7?/=0,11—0,13, которое было обнаружено в покровных тканях Любимца и в эпидермисе Приекульского. Площадь пятен этого соединения в сухом эпидермисе Любимца колебалась в зависимости от срока отбора пробы от 640 до 841 мм2, а в сухом эпидермисе Приекульского — от 400 до 475 мм2.

Наиболее обедненной фенольными соединениями оказалась крахмалсодержащая паренхима сорта Приекульский. Здесь было обнаружено всего пять соединений, одно из которых являлось хлорогеновой кислотой.

Как показали результаты количественных определений (табл. 5), проводившихся на спектрофотометре, уровень содержа- Таблица 5

Изменение содержания (мг %) хлорогеновой и кофейной кислот в различных частях клубней картофеля в период хранения

Примечание: в таблице приведены цифры, характеризующие реальное содержание хлорогеновой и кофейной кяслот в исследуемых тканях. Приведение полученных данных к первоначальному весу не сказалось па характере кривых, отражающих ход изменений изучаемых кислот в процессе хранения картофеля.

ния хлорогеновой кислоты, обнаруженной во всех тканях клубней как устойчивого, так и поражаемого сортов, выше всего в покровных тканях клубня — эпидермисе и субэпидермальном слое.

Однако направление изменений содержания хлорогеновой кислоты у сравниваемых сортов в ходе хранения было диаметрально противоположным.

Начиная с октября, содержание хлорогеновой кислоты в эпидермисе устойчивого сорта Любимец начинает резко снижаться и к марту она практически исчезает из этого слоя. В субэпидер- мальном слое содержание хлорогеновой кислоты к этому времени составляет немногим болео 50% от содержания ее в момент закладки на хранение.

Обратная картина наблюдалась у поражаемого сорта. Как в эпидермисе, так и в субэпидермальном слое содержание хлорогеновой кислоты в ходе хранения неуклонно возрастает. К марту количество ее в эпидермисе увеличилось более чем в 0 раз, а к маю — почти в 10 раз.

Наглядное представление о диаметрально противоположном направлении превращений хлорогеновой кислоты в устойчивом и поражаемом сортах картофеля дают кривые изменения содержания ее в ходе хранения в наиболее богатых этим соединением тканях клубней — эпидермисе и субэппдермалыюм слое (суммарно) (рис. 1).

Кофейная кислота (см. табл. 5) была обнаружена в обоих сортах только в эпидермисе н субэпидермальном слое, причем как в устойчивом, так и в поражаемом сорте наблюдалось неуклонное нарастание содержания этого соединения в ходе хранения. К концу хранения содержание кофейной кислоты в покровных тканях обоих сортов возросло более чем в пять раз. Однако уровень ее был также несколько выше в тканях поражаемого сорта (см. рис. 1).

Таким образом, полученные данные не давали основания предполагать, что повышенная сопротивляемость устойчивого сорта связана с большим содержанием кофейной кислоты, которая, как уже указывалось выше, обладает свойством подавлять рост мицелия PH. т1в8(ап8.

По-видимому, в сложной системе, которую представляют собой ткапи живого растения, содержание отдельных соединений в той или иной ткани не может являться решающим фактором в борьбе растения с патогеном.

Весьма возможно, что в этом случае важно не абсолютное содержание того или иного соединения, хотя бы и токсичного для данного патогена, а соотношение между содержанием веществ, подавляющих рост и развитие этого патогена, и содержанием веществ, стимулирующих эти процессы.

Поскольку хлорогеновая и кофейная кислоты являются основными фенольными соединениями клубней картофеля и вместе с тем обладают диаметрально противоположным действием по отношению к PH. т1ез1ап8, можно было предположить, что в разбираемом случае решающую роль может играть соотношение между содержанием этих соединений.

Как можно видеть на рис. 2, в начале периода хранения (сентябрь—ноябрь) величины этого отношения в покровных тканях исследуемых сортов были довольно близкими и более того у поражаемого сорта они даже несколько выше. Однако по мере выхода клубней из покоя величина этого отношения у устойчивого сорта начала резко возрастать. К марту она увеличилась в 17 раз, а к концу хранения более чем в 40 раз. В то же время у поражаемого сорта уровень этой величины за время хранения не изменился.

Что касается изменения содержания хлорогеновой и кофейной кислот в некрозе, полученном в результате заражения Рк. ш/ея- 1апз на клубнях устойчивого сорта (Любимец) ц в пораженной ткани неустойчивого (Приекульский), то в этом случае не наблюдалось никаких закономерных изменений, связанных со сроками хранения (табл. 6).

Однако как в некрозе, так и в пораженной ткани было отмечено появление кофейной кислоты — соединения, отсутствующего в крахмалсодержащей паренхиме здоровых клубней, а также увеличение содержания хлорогеновой кислоты по сравнению с со^

Изменение содержания хлорогеновой и кофейной кислот в тканях клубней картофеля при заражении Ph. infestans

Исследуемая ткань

Л 10 б II М Є Д

Крахмалсодержащая паренхима здорового клубня*, мг°/0 . . . Некроз вместе с подлежащим слоем, мг% % от содержания в здоровой ткани . . .

Крахмалсодержащая паренхима здорового клубня, мг% . . . . Пораженная ткань, л г °/с % от содержания в здоровой ткани ....

* Крахмалсодерггащая паренхима использовалась в данном случае в качестве контроля в связи с тем, что заражение клубней картофеля Ph. infestans проводилось в области расположения этой ткани. держанием ее в том слое паренхимы здоровых клуонеи, на уровне которого проводилось заражение. Как повышение количества хлорогеновой кислоты, так и накопление кофейной было значительно ярче выражено у устойчивого сорта. Так, если в пораженной тканн содержание хлорогеновой кислоты увеличилось не более чем в 5 раз, то в некрозе оно возросло в 12—20 раз.

Что касается кофейной кислоты, то это соединение полностью отсутствовало в крахмалсодержащей паренхиме здоровых клубней. Между тем в пораженной ткапп содержание этого соединения составляло 4.1—6,5 жг%, а в некрозе 9,2—15,8 мг%.

Следует отметить, что характер изменения величины отношения содержания кофейной кислоты к содержанию хлорогеновой кислоты в некрозе и пораженной ткани в ходе хранения (рис. 3) очень близок к характеру изменений этой величины в покровных тканях изучаемых сортов. В некрозе, так же как и в эпидермисе и субэпидермальном слое, наблюдалось значительное повышение величины этого отношения. В пораженной ткани она резко снизилась уже к ноябрю, а к концу хранения дошла до нуля в связи

с полным исчезновением кофейной кислоты.

Наблюдаемая аналогия подтверждает предположение о том, что большее значение в устойчивости клубней картофеля к Ph. infestans имеет не абсолютное содержание тоги или иного соединения в тканях клубня, а величина отно шения содержания соединений, токсичных для патогена, к содержанию соединений, способных стимулировать его рост и развитие.

Чем больше абсолютное значение этой величины, тем выше должна быть устойчивость данного сорта к поражению. Возможно, что к группе соединений, токсичных для патогена, должны быть отнесены, кроме кофейной кислоты, и некоторые другие соединения. Сюда в первую очередь относятся скополнн II его агликон — скоиолетпн, а также ряд нендентифицированных соединений, присутствие которых, как было установлено нами ранее [16, 17], характерно для некроза, образующегося на клубнях картофеля устойчивых сортов в ответ на поражение Ph. infestans.

ВЫВОДЫ

Изучалась динамика изменений содержания хлорогеновой п кофейной кислот на протяжении периода храпения в клубнях картофеля сортов, различающихся по устойчивости к Ph. infestans.

Установлено, что хлорогеновая кислота содержится как во внешних, так и во внутренних тканях клубней, кофейная — только в эпидермисе и субэпидермальном слое. В устойчивом сорте к концу хранения хлорогеновая кислота в эпидермисе исчезает полностью, а в субэпидермальном слое количество ее ешь жается на 50%; в поражаемом сорте наблюдается обратная картина: к концу хранения содержание хлорогеновой кислоты возрастает почти в 10 раз. Содержание кофейной кислоты к концу хранения в обоих сортах увеличивается более чем в 5 раз. В ходе хранения идет непрерывное возрастание величины отношения содержания кофейной кислоты к содержанию хлорогеновой во внешних тканях клубней устойчивого сорта и снижение этой величины у поражаемого. Полученные результаты приводят

К заключению, что решающим фактором в устойчивости клубней картофеля к Ph. infestans является не абсолютное содержание в тканях клубня того или иного соединения, а величина отношения содержания соединений, токсичных для патогена (и данном случае кофейной кислоты), к содержанию соединении. lt; тп мулируклцПА рост п развитие патогена (б данном случае ,\\'м- рогеновой кислоты).

Л И ТЕРАТУРА

1. G. Johnson, L. A. S о h а а 1. Relation of clilorogenic acid to scab resistance in potatoes. —Science. 115, N 2997, 1952.
2. L. A. S с h a a 1. G. Johnson, A. Simond s. Comparison of scab resistance of potato tubers as indicated by the ferric chloride test. — Amer. Potato, J., 30, N 11, 1953.
3. G. Johnson. L. S с h a a 1. Clilorogenic acid and other ortiiodihydric phenols in scab-resistant Russet. Burbank and scab-susceptible Triumph potato lubers of different maturities. — Phytopathology, 47, N 5, 1957.
4. В. E. Соколова, О. H. Савельева, Г. А. Соловьева. О токен ч- ности хлорогеновой кислоты по отношению к грибу Phytophthora infestans. — Докл. АН СССР, 131. № 4, 1960.
5. В. Е. Соколова, О. Н. Савельева, Г. А. Соловьева. О токсичности кофейной п хинной кислот по отношению к грибу Phytophtora infestans. — Докл. АН СССР, 136, № 3, 1961.

С. R. Н. С. Cheng, A. F. Hanning. Phenolic compounds in potato tissues. — Food Res., 20, N 5, 1955.

7. Б. А. Рубин, В. А. Аксенова. Участие иолифенолоксидазной системы в защитных реакциях картофеля против Phytophthora infestans.— Биохимия, 22, вып. 1—2. 1957.
8. С. М. П р о к о ш е в, В. 3. Баранова. Хлорогеновая кислота в растениях. — В сб.: «Биохимия плодов п овощей», N° 5. М., Изд-во АН СССР. 1959.
9. J. Р о 1 i t s. Du role de l’acide clilorogenic dans la formation de membrans suherifiees. — Rev. cytol. et cvtophysioL veget.. 10, 1948.
10. H. W о 1 f f g a n g, G. M. Hoffma n. Die Bedeutung der Chlorogensiiure als Resistensfao.tor des Kartofelscborfes. — Ziichter, 29, N 7, 1959.
11. E. В a n с h e r, J. И 6 1 z i. Chlorogensaure in Zellsaft der Knolle von So- lanurn. — Mikroskopie, 15, N 7—8, 1960.
12. M. Z и с k e г, С. C. Lev y. Some factors which affect the synthesis of chlorogenic acid in disks of potato tuber. — Plant Physiol., 34, 1959.
13. С. И. П а ш к a p ь. К динамике хлорогеновой п кофейной кислот при созревавип и прорастании клубней картофеля. — Докл. АН СССР, 48. № 4. 1958.
14. В. Е. Соколова. II. И. Васюкова. О роли периферийного слоя в образовании некроза на клубнях картофеля, инфицированных Phytophthora infestans. — Докл. АН СССР, 160, № 3, 1965.
15. Л. В. М е т л и ц к и й, О. Л. О з е р е ц к о в с к а я, Г. И. Ч а л е н к о, Г. А. Строкова. О фунгитоксическом действии фенольных соединений, возникающих в клубнях картофеля при поранении. — Докл. АН СССР, 160, № 4, 1965.
16. В. Е. Соколова. О. Н. Савельева, Б. А. Руби н. Характер превращений хлорогеновой кислоты в клубнях картофеля, поражепных Phytophthora infestans. — Докл. АН СССР, 123, Л: 2, 1958.
17. В. Е. Соколова, Г. А. Соловьева. Динамика превращений хлорогеновой кислоты в клубнях картофеля, пораженных Phytophthora infestans. — Докл. АН СССР, 144, Л» 6, 1962.