ПРИЛОЖЕНИЯ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ (ФГУ "ВГНКИ")

УТВЕРЖДАЮ:

Директор ФГУ ВГНКИ ветпрепаратов, академик РАСХН

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по диагностике микозов животных, вызываемых грибами рода Malassezia

РАССМОТРЕНО:

На методической комиссии По препаратам против

инфекций

председатель комиссии, профессор

В .И.

Разработчики: сотрудники отдела качества и стандартизации лекарственных средств против микозов и микотоксикозов животных: зав. отд., к.в.н. Маноян М.Г., к.б.н. Овчинников Р.С., аспирант Ершов П.П.

« » 2007 г.

А.Н.Панин

« » 2007 г. 1. Общие положения

Настоящие методические рекомендации устанавливают метод диагностики микозов животных, вызываемых грибами рода Malassezia, в условиях ветеринарных лабораторий.

Возбудителем заболевания являются липофильные дрожжевые грибы рода Malassezia. Основной возбудитель - вид М. pachydermatis, реже диагностируются виды М. sympodialis, М. globosa и др. Грибы рода Malassezia являются представителями нормальной микрофлоры кожного покрова и слизистых оболочек животных. В условиях воздействия факторов, снижающих резистентность макроорганизма, популяция грибов многократно увеличивается, что приводит к развитию патологического процесса.

Malassezia-инфекции зарегистрированы у большинства видов домашних животных, повсеместно распространены. Протекают как правило в форме поражений слухового канала (отитов), в форме кожных поражений (дерматитов), реже - как поражения когтей, органов зрения (конъюнктивиты) и др. Течение заболевания как правило хроническое (от нескольких месяцев до нескольких лет), устойчиво к лечению антибиотиками. Общепринятого метода диагностики Malassezia -инфекций в ветеринарии не разработано.

Метод основан на выделении из патологического материала культур грибов рода Malassezia при посеве на питательные среды, их идентификации и количественном учете выросших колоний гриба.

Цель метода - выявление грибов рода Malassezia в очаге поражения и оценка плотности их популяции, выраженной в колониеобразующих единицах (КОЕ). Плотность популяции гриба рода Malassezia, превышающая нормальные значения, дает основания для утверждения его этиологической роли.

2. Материалы, оборудование и инструменты

- тампон-зонд в стерильном коллекторе с транспортной средой Эймса (например, производства Eurotubo (Испания) или аналогичный)

или тампон-зонд в стерильном сухом коллекторе или пробирке;

чашки Петри стерильные (стеклянные или пластиковые);

диски, импрегнированные антифунгальными препаратами (например, произовдства HiMedia (Индия) или аналогичные);

термостат, обеспечивающий нагрев до 370С;

микроскоп световой микробиологический;

предметные и покровные стекла для микроскопа;

спиртовая или газовая горелка;

микологический крючок или бактериологическая петля;

трафарет окружности (диметр 20 мм);

тубус металлический для трахеотомии.

Питательные среды.

Сусло-агар. Для приготовления сусло-агара используют неохмеленное пивное сусло с кислотностью 1,9-2,3 по Тернеру. Сусло подвергают дробной стерилизации текучим паром в течение трех дней по 30 мин. ежедневно. Пивное сусло разводят водопроводной водой до содержания углеводов по Баллингу 7-80, устанавливают рН до стерилизации 7,0-7,4, добавляют 2,5- 3,0% агар-агара, кипятят до растворения агара, фильтруют через ватно- марлевый фильтр, разливают в стерильную посуду. Стерилизуют 40 мин. при 0,5-0,8 атм. После стерилизации рН сусло-агара должен составлять 6,3-6,8.

Среда Сабуро (состав г/л)

Пептон ферментативный - 10 г

Агар-агар - 20 г

Глюкоза - 20 г.

Вода водопроводная - до 1 л

рН после стерилизации - 5,4-5,8

Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 110-112С и давлении 0,5 Мпа в течение 20 минут.

Среда Барфатини (липид-содержащая)

В 1 литр расплавленной среды Сабуро добавляют 20 смЗ подогретого оливкового масла и 2 смЗ твин-80.

Селективные добавки:

Хлорамфеникол (производства Oxoid (Великобритания) или аналогичная).

Перед использованиеу питательные среды расплавляют на водяной бане и после их охлаждения до 45-50°С в среду Сабуро (или сусло-агар) вносят селективную антибактериальную добавку в соответствии с инструкцией изготовителя. Среду Барфатини используют без селективных добавок. Питательные среды тщательно перемешивают, разливают в чашки Петри и дают остыть на ровной горизонтальной поверхности. Слой среды в чашках должен быть не менее 0,5 см.

3. Сбор анамнестических и клинических данных

На животное, поступившее на амбулаторный прием с клинически выраженными кожными поражениями (дерматитами) или поражениями наружного слухового прохода составляют карту, отражающую следующие сведения:

вид животного, порода, пол, возраст, условия содержания, рацион;

наличие в истории болезни инфекционных, паразитарных и незаразных заболеваний (обращая особенное внимание на пищевые аллергии, ато- пические дерматиты, гормональные патологии, паразитарные заболевания кожи);

использование при лечении антибиотиков, гормональных препаратов;

При описании клинической картины при поражениях слухового канала (отитах) учитывается:

течение (острое / хроническое);

локализация (односторонняя / двухсторонняя);

характер экссудата (гнойный / церуминозный / жировой;

наличие гиперемии, мацерации, гиперкератоза, лихенизации;

наличие зуда, расчесов, самотравмирования;

Клиническая картина Malassezia-OTHTa представлена на рис. 41, 42.

При описании клинической картины при поражениях кожи (дерматитах) учитывается:

течение (острое / хроническое);

локализация, площадь поражения;

наличие и характер экссудата;

наличие гиперемии, лихенизции, мацерации, гиперкератоза;

образование комедонов;

изменения пигментации кожи;

наличие зуда, расчесов, самотравмирования;

Клиническая картина Malassezia -дерматита представлена на рис. 43, 44.

4.

За 5-7 дней до отбора пробы прекращают медикаментозную обработку мест поражений животного (если она проводилась).

Перед отбором пробы из кожных поражений проводят выстригание волос до высоты не более 1 мм.

При локализации поражения в слуховом канале стерильный там- пон-зонд вводят в слуховой канал через стерильный металлический тубус, проворачивают тампон вокруг своей оси на 360 градусов, извлекают и помещают в коллектор с транспортной средой или пробирку (рис. 45).

При отборе проб из кожных поражений после предварительной обработки на место отбора пробы накладывают обеззараженный трафарет окружности с внутренним диаметром 20 мм и двумя-тремя круговыми движениями выполняют мазок стерильным тампоном-зондом (рис. 46).

Транспортировка, хранение образцов патматериала до начала лабораторного микологического исследования:

- в сухом коллекторе или пробирке - срок хранения образцов не более 2 сут. при 5-80 С;

- в коллекторе с транспортной средой - не более 7 сут. при 5-80С.

5. Проведение лабораторного микологического исследования

Посев образцов патматериала проводят на следующие питательные среды в чашках Петри:

а) среда Барфатини;

б) среда Сабуро (или сусло-агар) с добавлением хлорамфеникола или другой антибактериальной селективной добавки.

Посев проводят с соблюдением правил асептики, вблизи пламени горелки, методом штриха, по 6 штрихов на чашку. Используют минимум две чашки каждой среды.

Культивирование посевов проводят в термостате в аэробных условиях в течение 3-5 сут. при 37°С.

Учет результатов посевов:

5.3.1. Определяют наличие роста колоний грибов рода Malassezia на основании макро- и микроморфологических признаков. На среде Барфатини наблюдают рост кремовых или желто-коричневых колоний, слегка морщинистых, матовых, края ровные или слабо-фестончатые, обратная сторона колоний светло-коричневая. На 5-е сут. роста как правило наблюдается образование зоны помутнения среды вокруг колоний. Диаметр колоний 4-7 мм (рис.47)

На сусло-агаре (или среде Сабуро) с хлорамфениколом колонии выпуклые, желто-коричневые, гладкие, матовые, края ровные, обратная сторона колоний светло-коричневая, диаметр колоний 2-4 мм. Зона помутнения среды вокруг колоний не образуется (рис.48).

При микроскопии культур наблюдают дрожжевые клетки, одиночные и в скоплениях, почкующиеся, почкование однополярное, перкуррентное. По форме почкующиеся клетки напоминают «отпечаток стопы» или «земляной орех». Ширина дочерней клетки может быть меньше или равна материнской. Размер клеток 3-6x2-3 мкм. Псевдомицелий не образуется (рис. 49).

Проводят подсчет колоний грибов рода Malassezia на среде Барфатини (при отсутствии контаминации, затрудняющей подсчет). При наличии контаминации на среде Барфатини подсчет колоний проводят на сусло- агаре с хлорамфениколом. При дальнейшей оценке плотности популяции гриба учитывают, что жизнеспособность грибов рода Malassezia на данной среде в среднем в 2,5 раза ниже, нежели на среде Барфатини.

Оценку плотности популяции грибов рода Malassezia проводят по результатам учета колоний на среде Барфатини:

а) При росте единичных колоний Malassezia spp. (до 10 КОЕ в образце) плотность популяции оценивают как низкую, не имеющую клинического значения. Результат анализа отрицательный;

б) При росте более 20 КОЕ в образце плотность популяции оценивают как аномально высокую, имеющую клиническое значение. Результат анализа положительный;

в) При росте 10-20 КОЕ в образце результат оценивают как сомнительный, оценку клинической роли проводят с осторожностью, учитывая совокупность других клинических данных.

Видовая идентификация выделенного гриба рода Malassezia.

а) При наличии роста колоний как на липид-содержащей среде Барфатини, так и на среде без липидов (сусло-агаре или агаре Сабуро), вид идентифицируют как М. pachydermatis (основной возбудитель Malassezia- инфекций, не являющийся липди-зависимым);

б) При наличии роста колоний на среде Барфатини и отсутствии роста на среде без липидов изолят гриба рода Malassezia оценивается как липид- зависимый, его видовую идентификацию при необходимости проводят в специализированной ветеринарной микологической лаборатории на основании изучения физиологических свойств. 5.3.5. Помимо роста грибов рода Malassezia, принимают во внимание наличие роста на питательных средах других клинически значимых микроорганизмов (бактерий, грибов).

6. Определение чувствительности выделенной культуры гриба рода Malassezia к антифунгальным препаратам

Проводят диско-диффузионным методом, используя диски, импрегни- рованные следующими антифунгальными препаратами:

нистатин (используется для местной терапии);

клотримазол (используется для местной терапии);

кетоконазол (используется для местной и системной терапии);

итраконазол (используется для системной терапии);

флуконазол (используется для системной терапии).

Степень чувствительности культуры к каждому из препаратов оценивают по диаметру зоны задержки роста культуры вокруг диска, в соответствии с инструкцией изготовителя дисков. Препарат, проявивший наибольшую антифунгальную активность в отношении выделенного изолята Malassezia spp., целесообразно рекомендовать для дальнейшей терапии Malassezia - инфекции.

Рис. 41. Клиническая картина Malassezia-OTHTa у собаки (гиперемия, коричневые пастообразные выделения)

Рис. 43. Клиническая картина Malassezia-дерматита у собаки с локализацией в области губ, глаз

Рис. 45. Отбор пробы патологического материала из слухового канала

Рис. 44. Malassezia-AepMaTHT у собаки с локализацией в области свода стопы и межпальцевых пространств

Рис. 46. Отбор пробы патологического материала из кожных поражений

Рис. 47. Морфология колоний М. pachydermatis и образование зон преципитации на среде Барфатини

Рис. 49. Микроморфология М. pachydermatis. Почкующиеся дрожжевые клетки в форме «отпечатка стопы»