Изучение способности к колонизации корней растенийу стрептомицинрезистентного штаммаPseudomonas aureofaciens ИБ 51 и ампициллинрезистентного штаммаAzotobacter vinelandii ИБ 4 P

Для изучения динамики численности клеток пггаммов-анта- гонистов на зерне пшеницы на среде Кинг В была наработана двухсуточная КЖ штамма Р. aureofaciens ИБ 51str (титр 108 КОЕ/мл) и соответственно на среде Федорова - двухсуточная КЖ штамма Az. vinelandii ИБ 4М1,р (титр 8,0* 109 КОЕ/мл).

Нестерильные зерна яровой пшеницы обрабатывали из расчета 1105 КОЕ/зерно. В качестве стабилизатора клеточной биомассы Р. aureofaciens ИБ 51str на поверхности зерен использовали 2%-, 10%- и 20%-ные стерильные растворы сахарозы, которые смешивали с КЖ в соотношении 1:1. Обработанные зерна хранили в стеклянных колбах, закрытых ватно-марлевыми пробками, в холодильнике (6°).

Численность интродуцированных микроорганизмов на семенах определяли высевом с 5 зерен. Инокулированные семена помещали в ступку с 10 мл стерильной воды и легко растирали для удаления верхнего слоя с семян. Из полученной суспензии готовили ряд последовательных разведений, которые высевали на МПА со стрептомицином (1000 мкг/мл) либо на среду 40 с ампициллином (1500 мкг/мл). Через 3 сут инкубации в термостате при 28° подсчитывали число выросших колоний и определяли количество КОЕ в расчете на 1 семя.

Колонизирующую способность штаммов Р. aureofaciens ИБ 51str и Az. vinelandii ИБ Ф^р изучали в условиях вегетационных опытов на яровой пшенице и огурцах.

Была проведена предпосевная обработка семян пшеницы и огурца двухсуточной КЖ штамма Р.

Для вегетационного опыта на пшенице использовали пластиковые стаканы объемом 0,5 л, заполненные нестерильной серой лесной почвой. Высаживали по 10 зерен на стакан, глубина заделки - 1,5-2 см. Влажность почвы на протяжении опыта поддерживали на уровне оптимальной, соответствующей 60% от полной влагоемкости. Опыт продолжительностью 60 сут проводили при комнатной температуре и естественном освещении.

Вегетационный опыт на огурцах сорта Пионер проводили с использованием пластиковых стаканов объемом 0,2 л. В качестве субстрата для выращивания растений применяли промытый, просеянный, прокаленный песок. В каждый стакан помещали по одному инокулированному семени огурца, глубина заделки семян - 4—5 см. Поддержание оптимальной для развития растений влажности песка, а также питание растений осуществляли за счет полива последних раствором Кнопа для выращивания стерильных растительных культур [Сеги, 1983]. Для обеспечения оптимума температурного и светового режима для культуры огурца опыт проводили с использованием искусственного освещения (светоплощадка). Температуру поддерживали на уровне 23-25°. Продолжительность опыта - 105 сут.

Изучение колонизации корней огурцов штаммом Az. vinelandii ИБ 4amP проводили на огурцах сорта Пионер в модельном лабораторном эксперименте, как это было описано выше. Семена замачивали в КЖ штамма Az. vinelandii ИБ 4мпр с титром 4107 КОЕ/мл в течение 4 ч, затем сажали в пластиковые стаканы.

Процесс колонизации ризосферы пшеницы интродуцирован- ными клетками штамма Р. aureofaciens ИБ 51str изучали также в условиях полевого эксперимента на опытном участке совхоза им. Цюрупы, а штамма Az. vinelandii ИБ 4amP - на опытном поле учебного хозяйства БГАУ (пос. Миловка). Обработку семян проводили из расчета 104 КОЕ/семя. Семена высаживали в рядки - по 100 семян/рядок, расстояние между рядками - 15 см.

Анализ плотности популяции интродуцированных микроорганизмов со всей корневой системы сельскохозяйственных культур (пшеница, огурец) проводили на разных фазах развития растений. Для анализа корни каждого образца с приставшими к ним частицами почвы или песка увлажняли до состояния пасты, растирали в стерильной ступке и помещали в колбы со 100 мл стерильной воды. Колбы встряхивали на качалке в течение 20-30 мин. Из полученной суспензии готовили ряд последовательных разведений, которые высевали на агаризованную среду с антибиотиком. Чашки Петри инкубировали в термостате при 28° в течение 3 сут. Численность бактерий, выросших на чашках Петри, пересчитывали на 1 г массы сухих корней и ризосферной почвы (песка) (КОЕ/г) или КОЕ/растение. Для микробиологического исследования ризосферы пшеницы брали по 10 растений, огурца - по 3 растения.

Для оценки влияния, которое может оказывать интродукция штамма-антагониста в почву на аборигенную микрофлору ризосферы пшеницы, изучали динамику численности микроорганизмов в ризосфере пшеницы в варианте без обработки (контроль) и с обработкой семян клетками штаммов-антагонистов. Для выявления численности гетеротрофных микроорганизмов высев осуществляли на среду МПА, олигонитрофилов - на среду Эшби, микромицетов - на среду Чапека, спорообразующих микроорганизмов - на среду МПА с предварительным прогреванием суспензии микроорганизмов соответствующего разведения в течение 10 мин при 80°, актиномицетов - на КАА [Разумовская и др., 1960]. Численность бактерий выражали количеством КОЕ на 1 г массы сухих корней или ризосферной почвы.

Наличие у бактерий, относящихся к группе PGPR, способности к активной колонизации корней растения-хозяина дает им заметное преимущество среди микроорганизмов, обладающих антагонистическими свойствами, но не конкурентных в новых условиях обитания [Caponlgro, Contillo, 1986; Кравченко, Макарова, 1993]. Приживаемость в ризосфере интродуцированного микроорганизма зависит от многих факторов, но в первую очередь определяется самим бактериальным штаммом, видом и сортом растения.

Целью исследования было изучить колонизирующую способность штаммов-антагонистов Р. aureofaciens ИБ 51 и Az. vinelandii ИБ 4. В экспериментах использовали штамм Р. aureofaciens ИБ 51str, устойчивый к стрептомицину, и ампициллинрезистентный штамм Az.vinelandii ИБ 4атР.

В начальной серии экспериментов была поставлена задача изучить выживаемость клеток штаммов-мутантов Р. aureofaciens

Примечание, нд

ИБ 51str и Az. vinelandii ИБ 4amP на поверхности зерен пшеницы. Установлено, что срок жизнеспособности клеток на зерне крайне ограничен. В течение 1,5 нед после инокуляции зерен численность популяции штамма-антагониста Р. aureofaciens ИБ 51str на их поверхности снижается в 50 раз, а через 20 дней после бактеризации вообще не удалось обнаружить на семенах жизнеспособных клеток штамма (табл.

Для продления срока выживания штамма псевдомонады на посевном материале пшеницы была использована обработка семян суспензией клеток штамма-антагониста совместно с растворами сахарозы в различных концентрациях (табл. 32).

Данная обработка способствовала поддержанию на семенах титра бактерий, на 2 порядка превышающего контрольные значения. Даже по истечении 3 нед, когда в контрольном варианте уже не обнаруживали клеток штамма-антагониста, использование 10%- и 20%-ного сахарного раствора способствовало сохранению на зернах жизнеспособных клеток. Подобный положительный эффект может быть обусловлен защитным действием, которое оказывает раствор сахарозы, препятствуя высушиванию и гибели бактериальных клеток [Методы.., 1984].

В отношении штамма азотобактера показано, что он способен выживать на зернах пшеницы в течение 3 мес, что, по- видимому, объясняется его способностью сохраняться на поверхности зерен длительное время в виде цист. Однако общее количество клеток на поверхности зерен постепенно снижалось (см. табл. 32).

Таким образом, показана способность азотобактера длительное время выживать на поверхности зерен пшеницы, что дает

возможность предварительной обработки посевного материала, а, следовательно, речь идет об экономии времени и трудозатрат в день посева.

Изучение процесса колонизации корней сельскохозяйственных растений штаммами-антагонистами проводили также в условиях вегетационных и полевых экспериментов.

В вегетационном опыте с пшеницей в течение всего периода наблюдений вплоть до гибели растений (60 сут), титр жизнеспособных клеток нггамма-антагониста Р. aureofaciens ИБ 51str в ризосфере не только не снизился по сравнению с исходным значением, а увеличился на порядок. В опыте показано, что культура нггамма-антагониста Р. aureofaciens ИБ 51str не только обладает хорошей колонизирующей способностью, но и характеризуется стабильной антагонистической активностью. Последний факт был подтвержден при проверке антигрибной активности повторно выделенного из ризосферы растений нггамма-антагониста (табл. 33).

Изучение колонизации ризосферы огурца штаммами-антагони стами проводили в вегетационном опыте, в котором субстратом для развития растений служил стерильный песок. Начальная численность интродуцентов составила 106 КОЕ/семя. Как видно

str

Таблица 33. Динамика численности штамма Р. aureofaciens ИБ 51 в ризосфере пшеницы (вегетационный опыт)

Таблица 34. Динамика численности штаммов Pseudomonas aureofaciens ИБ 51su и Az. vinelandii ИБ 4amp в ризосфере огурца (вегетационный опыт)

из табл. 34, динамика развития штаммов-антагонистов в ризосфере огурца различна. Численность штамма Р. aureofaciens ИБ 51str достигала максимума на 45-е сутки эксперимента и снижалась к концу опыта, тогда как увеличение популяции Az. vinelandii ИБ 4amP продолжалось в течение всего эксперимента.

Антагонистическая активность штаммов сохранялась на высоком уровне на протяжении всего срока наблюдений (см. табл. 34).

Изучение колонизирующей способности новых штаммов-антагонистов было продолжено в условиях полевых опытов.

В полевом эксперименте количество жизнеспособных клеток штамма Az. vinelandii ИБ 4^ в период активного роста пшеницы (в фазу третьего листа) составляла 14,2 • 109 КОЕ/г корней, но постепенно численность интродуцента снижалась и на период восковой спелости составила 1,4 • 106 КОЕ/г (табл. 35). Снижение титра может быть обусловлено дефицитом углеродного питания

Таблица 35. Динамика численности штаммов Р. aureofaciens ИБ 51str и Az. vinelandii ИБ 4amp в ризосфере пшеницы (полевой опыт)

в ризосфере отмирающих корней пшеницы, объем корневых эксудатов которых значительно ниже по сравнению с таковыми интенсивно развивающихся растений.

В полевом опыте антагонистическая активность штамма Az. vinelandii ИБ 4апчgt;, выделенного из ризосферы пшеницы на начальном этапе развития растений и в фазе кущения, оставалась на исходном высоком уровне, но к моменту восковой спелости пшеницы фунгицидная активность не обнаружена (см. табл. 35). В момент активного роста зеленой массы растения наиболее уязвимы из-за активного заселения корней различными видами микроорганизмов, в том числе и фитопатогенными, поэтому штамм, активно развивающийся в ризосфере в первую половину вегетации, может обеспечить защиту растения от корневых инфекций.

Анализ численности штамма Р. aureofaciens ИБ 51s* в ризосфере пшеницы показал, что популяция антагониста сохранила стабильность на протяжении всего вегетационного сезона. Способность подавлять развитие фитопатогенных грибов также не снижалась (см. табл. 35)

Анализ доли интродуцированного штамма Р. aureofaciens ИБ 5 Is* в составе микробиоты ризосферы пшеницы показал, что численность штамма-антагониста по отношению к общей численности гетеротрофных микроорганизмов в ризосфере пшеницы колебалась в течение полевого сезона в пределах 0,4-2,7%. Максимум численности штамма Р. aureofaciens ИБ 51str (2,7% от общей численности гетеротрофных микроорганизмов) отмечен в фазе третьего листа - через месяц после посева. В фазе кущения, когда численность гетеротрофных микроорганизмов достигла своего максимального значения и возросла по сравнению с фазой третьего листа в 2,4 раза, количество интродуцированных микроорганизмов постепенно снижалось, и именно в этот период на долю штамма-мутанта приходится минимальный процент присутствия в ризосфере по сравнению с общей численностью микроорганизмов. Далее наблюдалось быстрое снижение общей численности микроорганизмов (в период, предшествующий уборке урожая, по сравнению с фазой кущения титр гетеротрофных микроорганизмов снизился в 4,9 раза). Титр клеток штамма Р. aureofaciens ИБ 5 lslr за аналогичный период уменьшился всего в 2 раза, и за счет этого доля штамма-мутанта в ризосфере опять возросла почти до 1% и составила в период восковой спелости зерна • 10* КОЕ/г корней.