ЛЕЙКОЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Leukaemia in cattle, Bovine leukosis (англ.); Enzootische Rinderleukose (нем.); Leukose bovine (франц.)

Лейкозы животных диагностируют почти во всех странах мира. Наиболее широко они распространены в США, ряде стран Центральной Европы, Дании, Швеции и странах Ближнего Востока. В довоенной Германии на 10000 молочных коров приходилось 39-150 опухолевых форм лейкоза. В Восточной Германии заболеваемость возросла в 1975 г. с 111 случаев на 10000 голов до 248 в 1985 г. (74). Постоянно растет число случаев лимфосаркомы, выявленных на бойнях США. В 1917-1925 г. на 10000 убитых коров приходилось 0,4-0,6 случаев, а в 1958 и 1964 г. заболеваемость составила 1,8 и 1,7 соответственно. Потери от выбраковки туш с опухолевым лейкозом в США в 1978 г. оценивали в 7 млн. долларов. Эта сумма не отражает реальных потерь, поскольку не учитывает ущерб от падежа и вынужденного убоя заболевших животных непосредственно на фермах. Экономический расчет показал, что в Великобритании потери от лейкоза за 25 лет могут составить 4,8 млн. фунтов стерлингов (58). В Турции, куда лейкоз был завезен с племенным скотом из Швейцарии, количество больных животных составило 4,5%. Лейкоз установлен также в Африке и Австралии. В нашей стране возникновение лейкоза связано с завозом племенного скота в 1940, 1945-1947 гг. из Германии в хозяйства Западной Сибири, Московской, Ленинградской, Калининградской областей, а также Украины, Латвии и Литвы (31).

Симптомы и патологоанатомические изменения. Различают 2 основные формы лейкоза КРС: энзоотическую и спорадическую. Последняя форма встречается редко и поражает молодых животных (до 3-летнего возраста), проявляется клинико-морфологическими разновидностями: 1) ювинальный лейкоз (форма лейкоза у телят) - наиболее часто наблюдается у телят моложе 6-мес возраста; характеризуется увеличением лимфоузлов и часто инфильтрацией костного мозга; 2) тимусная форма лейкоза встречается у телят моложе 2-летнего возраста; характеризуется увеличением тимуса; 3) кожная форма встречается у телят от 1 до 3- летнего возраста; характеризуется узелковой лейкемической инфильтрацией кожи.

Спорадический лейкоз не представляет особого интереса в экономическом плане. Этиологический агент при этой форме болезни не выявлен.

Энзоотический лейкоз - контагиозная болезнь с длительным латентным периодом, во время которого в крови выявляют вирус лейкоза КРС (ВЛКРС) и АТ к нему. В основном встречается у крупных животных, наиболее часто в возрасте 5-8 лет. Болезнь характеризуется пролиферацией неопластических элементов, в результате чего образуются отдельные опухолевые массы и (или) диффузная инфильтрация различных тканей и органов. В опухолевый процесс вовлекаются лимфоузлы (Рис.

Согласно современным данным, энзоотический лейкоз КРС объединяет две группы болезней. Опухолевые болезни первой группы характеризуются инфильтрацией лимфоцитами органов кроветворения с вовлечением в патологический процесс костного мозга (лимфоид ный, миелоидный, слабо дифференцированный и недифференцированный лейкозы с различными вариантами). Болезни второй группы (лимфо-, ретикулосаркома, лимфогранулематоз) сопровождаются опухолевым ростом, первично проявляющимся в лимфоидной ткани (лимфоузлах, селезёнке и других органах). Типично протекающий энзоотический лейкоз в терминальной стадии характеризуется потерей массы, анемией, снижением молочной продуктивности и увеличением одного или нескольких периферических лимфоузлов. Заболевание неизменно заканчивается смертью животного через несколько недель или месяцев после проявления клинических признаков.

У больных лейкозом животных установлены определённые числовые и структурные изменения хромосом клеток гемопоэтических органов. Наиболее часто обнаруживается гипер- плоидия. В стадах с высокой заболеваемостью лейкозом с помощью гематологических исследований могут выявляться клинически здоровые животные с устойчивым лимфоцитозом (62). Примерно в 70% случаев развитию опухолевой стадии лейкоза предшествует период обычно в несколько лет, в котором у животных отмечается устойчивый лимфоцитоз без клинических признаков болезни. Ассоциация между энзоотическим лейкозом и персистентным лимфоцитозом указывает на то, что оба состояния вызываются одним инфекционым агентом. Эта гипотеза была подтверждена после того, как был открыт BJIKPC.

Патогенез. Патогенез при лейкозе коров изучен недостаточно; АГ вируса обнаруживают только в лимфоцитах инфицированных животных после краткосрочного культивирования in vitro.

ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Почти на протяжении века ученые многих стран проводили исследования по изучению этиологии этого заболевания и лишь 1969 г. вошел в историю как год открытия ВЛКРС (62, 84). В последующих работах детально изучена морфология и морфогенез вируса и установлена его онкогенная активность в прямых опытах по заражению овец и телят с последующей реизоляцией возбудителя (3, 62, 75, 83, 84). На 21 Международном симпозиуме по лейкозу КРС (Брюссель, 1976) была принята резолюция, в которой отмечено: “Вирус бычьего лейкоза следует официально признать определяющим фактором в этиологии энзоотического лейкоза. В государственных программах, регламентирующих борьбу с лейкозом КРС, следует предусмотреть использование серологических тестов, направленных на выявление противовирусных АТ (52, 53).

Вирус является этиологическим агентом бычьего лейкоза и получил название “вирус лейкоза крупного рогатого скота” (ВЛКРС), или Bovine Leukemia virus (BLV). Эго экзогенный онковирус типа С, отличающийся от всех известных вирусов типа С млекопитающих. BLV широко распространён в стадах (до 75%). Относится к семейству Retroviridae, подсемейству Oncornaviridae. Вместе с недавно открытым вирусом Т-клеточного лейкоза человека (HTLV), ВЛКРС относится к особой группе, обозначенной типом Е (40, 41, 62, 84).

Морфология и химический состав. Зрелые вирионы ВЛКРС содержат центральнорасположенный электронно-плотный нуклеоид, диаметр которого, в зависимости от методов фиксации и обработки препарата, варьирует от 40 до 90 нм. Центральная часть нуклеоида отделена от внешней вирусной оболочки промежуточным слоем. Гексагональное очертание нуклеоида в ультратонких срезах предполагает икосаэдрическую симметрию. Внешняя вирусная оболочка представлена 2-контурной мембраной, которая лабильна, из-за чего диаметр вирионов может сильно варьировать - от 73 до 120 нм. На поверхности внешней оболочки выявляют шипики (пегагамеры) с пуговкообразным утолщением на конце, длиной 8- 11

нм, которые состоят из субъединиц, образованных двумя гликозилированными вирусными белками gp51 и gp30, отвечающими за типоспецифичность. Вирионы имеют плавучую плотность в растворе сахарозы и CsCl, равную 1,15-1,18 г/мл и 1,17-1,33 г/мл соответственно. Химический состав вирионов: протеины 60%, липиды 35, нуклеиновые кислоты 2,2, углеводы 0,5% (6, 55).

В структуре BJIKPC обнаружено 6 основных белков с мол.м. от 10 до 51 кД (рЮ, р12, р15, р24, gp30 и gp51) (95,97,116). Четыре негликозилированных белка (рЮ, р12, р15, р24) составляют сердцевину вириона, причем белок р24 присутствует в наибольшем количестве (38). Два крупных белка являются гликопротеинами - один из которых (р51) расположен на поверхности вириона, другой (рЗО) - трансмембранный белок (107). BJIKPC обладает выраженной антигенной активностью и индуцирует синтез ВНА и КСА. Он агглютинирует эритроциты мышей. За инфекционность (94) и ГА активность ответственен gp51 (113). В gp51 выявлено 3 эпитопа, ответственных за нейтрализацию вируса. Поли- и монАТ против gp51 обладают ВН-активностью (70, 71, 72, 73, 76, 82, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 112), подавляют синцитийобразующую активность вируса, препятствуют выходу из клеток и вызывают лизис инфицированных клеток в присутствии комплемента. Оболочка ВЛ КРС содержит 2 белка gp60 (гликопротеин поверхности вириона) и рЗО (межмембранный белок) (109).

Геном вируса может существовать в 2-х формах, геномной 1-цепочечной РНК или в виде ДНК, синтезированной на геномной РНК как на матрице, и интегрированной в хромосому клетки-хозяина в виде провируса. Геномная РНК содержится только в зрелых вирионах. В жизненном цикле вируса геномная РНК функционирует лишь 1 раз, когда служит матрицей для фермента - обратной траискриптазы при биосинтезе комплементарной ДНК. Весь объем биохимических процессов, необходимый для полной репликации вируса, выполняется с участием ДНК-провируса (60, 65). Геном состоит из 8714 нуклеотидных последовательностей и имеет следующую организацию: 5'LTR-gag-pol-env-pX(BL)-3'LTR (56). Геи gag - кодирует трансляцию группоспецифического белка прдшественника структурных белков, в частности р24; ген pol- полимеразу, которая транскрибируется с ДНК в составе общего с геном gag транскрипта “gag-pol”. В результате процессинга получаются следующие продукты: обратная транскриптаза 66-55кД, протеаза ЮкД, эндонуклеаза 15кД; ген env - кодирует трансляцию белка предшественника гликозилированных белков наружной оболочки вируса; ген pX(BL) - трансактиватор транскрипции (tat), кодирует регуляторные трансактиваторные белки. Гены env, gag и pol называют структурными, так как кодируемые ими белки являются структурными белками зрелого вируса или ферментами.

Длинные концевые повторы (LTR) состоят из 530 пар нуклеотидов с обратным повтором в 6 пар оснований на 5’- и 3’- концах, фланкированных прямыми повторами в 6 пар оснований из ДНК клетки хозяина. При сравнительном исследовании способности LTR HTLV1, HTLV 2 и BJIKPC функционировать в качестве усилителя транскрипции установлено: LTR BJIKPC увеличивает экспрессию гена, направляемого с дистального гетерогенного промотора, причем в отличие от усилителя транскрипции LTR-HTLV-1, который активен в незараженных клетках лимфоидного и нелимфоидного происхождения, усиливающее действие LTR-BBJI и LTR-HTLV-2 проявлялось только в инфицированных этими вирусами клетках (101). Для RTL ВБЛ характерен удлиненный участок R (228 пар оснований), разделяющий сигнал присоединения poly(A) (А-А-Т-А-А) от ро1у(А) сайта на 260 пар оснований. R-участок образует стабильную шпилечную структуру на молекуле РНК, способствуя соеди нению обоих терминирующих кодонов и обеспечивая нормальную терминацию цепи. Такая структурная организация LTRBEJI, аналогична организации LTR вируса Т-клеточного лейкоза человека, а также умеренная гомология последовательностей (более 50%), установленная между R-участками 2-х ретровирусов, указывает на их эволюционное родство (106).

Первую открытую рамку считывания составляет ген gag из 1179 пар оснований (с 628 по 1806), начинающейся с первого триплета ATG. Он кодирует белок-предшественник со структурой NH2-pl5-p24-pl2-COOH, соответствующий ранее описанному белку, обозначенному Рг45 (gag) (79). N-концевой белок состоит из 109 аминокислот, главный белок ядра (р24) состоит из 214 аминокислот и белок р12, связанный с РНК, из 69 остатков. Непосредственно на 3'-конце начинается новая открытая рамка считывания, которая обнаруживает высокую степень гомологии с протеазами вирусов птиц и млекопитающих (123). После участка протеазы имеется еще одна открытая рамка считывания для гена pol, кодирующая 852 аминокислоты (позиция с 2317 по 4875), которая обнаруживает умеренную гомологию по гену pol вирусов типа С птиц и млекопитающих. Продукт гена pol (95 кД ) превышает мол.м. ро1-кодируемой обратной транскриптазы ВБЛ (70 кД). Возможно, что этот ген кодирует также эндонуклеазу ВБЛ (32 кД). Третью рамку составляет ген env (нуклеотиды с 4821 по 6368), кодирующий 515 аминокислот поверхностного гликопротеида (gp51) и трансмембранного белка (gp30) (106). Размер рамки для env составляет 1446 нуклеотидов и позволяет осуществить синтез 2-х белков gp60 (268 аминокислот) и gp30 (env) (214 аминокислот) (99). Первичная структура рЗО (env) имеет 36% идентичности в аминокислотной последовательности соответствующего белка р24 (env) вируса Т-клеточного лейкоза человека. Меньший уровень гомологии установлен с белком р15 (белок Е) вируса лейкоза мышей и gp36 вируса саркомы Рауса. Степень родства gp60 ВБЛ и HTLV выражена меньше, чем у рЗО (env) ВБЛ и p21 (env) РЕ ДМ, но тем не менее является статистически достоверной. Сравнение нуклеотидной последовательности генов env и аминокислотной последовательности кодируемых ими белков-предшественников 7 изолятов ВБЛ позволило идентифицировать 2 подгруппы вирусов: японо-американскую (штаммы BLV-1, VdM и FLK-BLV) и европейскую (шт. Т15- 2,

LB285 и LB59), при этом изменчивость гена env составляла менее 6% (80). В австралийском изоляге ВБЛ (pBLV-Al) выявлены вариации в аминокислотном составе по сравнению с японскими и бельгийскими изолягами, особенно на уровне гена gag, в которых установлено 54 и 24 аминокислотных замещения соответственно. Вместе с тем установлены высоко консервативные аминокислотные последовательности внутри env и pol генов, включающие участки с эпитопами, ответственными за инфекционность вируса (57). За терминирующим кодоном env и началом З'-LTR идентифицирован участок рХ, состоящий из 1817 или 1800 пар оснований (59, 98, 99, 105). Исходя из функциональной активности и по аналогии с HTLV1 и HTLV2, для продукта участка рХ ВБЛ предложено название tat (трансакгиватор- ные белки) (102). Подтверждена иммунологическая идентичность естественного и рекомбинантного гликопротеинных АГ ВЛКРС и установлена принципиальная возможность использования рекомбинантного АГ для диагностических целей (12).

Структура провируса BLV. Порядок генов в провирусной ДНК длиной в 8190 пор нуклеотидов таков: длинный концевый повтор (ДКП) - gag - ген протеазы - pol-evn-tat ДКП. Регуляторные последовательности для транскрипции трансляции содержатся в ДКП. Обнаружена значительная гомология BLV с ретровирусами мышей и птиц, однако наиболее близок провирус BLV к ретровирусам человека HTZV I и HTZV И. Основные продукты генов env/gp51 gp30/ и tat/рЗ 8/. Два гликопротеина - gp51 и gp30 - находятся на поверхности вириона и клеток, заражённых BLV. ВЛКРС принадлежит к ретровирусам II класса; он не содержит нуклеотидных последовательностей клеточных онкогенов, но имеет длинную открытую рамку считывания, часть которой, по-видимому, составляет ген tat. Последний не экспрессируется ни в свежих опухолевых клетках, ни даже в неопластических лимфоцитах, культивируемых in vitro как постоянная линия клеток. Другие вирусные гены, кодирующие структурные белки gag и evn, не экспрессируются в опухолевых клетках (7). Этот недефектный ретровирус содержит 3 основных гена: gag, кодирующий белок, предшественник внутренних структурных белков вириона (группоспецифических антигенов); pol, кодирующий вирионную РНК-зависимую ДНК-полимеразу, и evn, кодирующий гликопротеид вирусной оболочки (gp51) и трансмембранный белок (gp30). Этих 3-х генов достаточно для обеспечения репликации вируса. ВЛКРС не содержит ген one, кодирующий специфический белок, трансформирующий клетки (40). Однако, он может трансформировать клетки путем активации клеточных генов ВНС, что сопровождается высоким уровнем трансформирующего белка, в результате чего следует пролиферация клеток, ведущая к развитию опухоли.

Устойчивость. Установлено, что ВЛКРС чувствителен к температурным воздействиям, разрушается при повторных замораживаниях и оттаиваниях и при нагревании до 5 6° С в течение 15 мин. Пастеризация молока (74°С в течение 16 с) разрушает его, и он теряет инфекционность для ягнят. Вирус обнаруживается в молоке после хранения в течение 72 ч при 1°С, при 10 и 14,5°С его не обнаруживают через 48 и 24 ч соответственно. Полная инактивация вируса в молоке или вируссодержащей жидкости установлена при 50°С в течение 70 с (100), при 70-74 °С в течение 17 с или при 56-63 °С в течение 5-30 мин (11), В цельном молоке, хранившемся при 1,1-5,5°С, происходит постепенное снижение титров ВЛКРС в течение 72 ч; при 9,9 и 14,4°С вирус не обнаруживался уже через 48 и 24 ч хранения (40). В сливках, собранных после отстоя цельного молока, при 1,1°С через 24, 48, 72 ч вирус был выделен только в пробах первых 2-х сроков отстоя. В разбавленном молоке (до 37,5%) инфекционность сохраняется в течение 12 ч. Если при pH 6,5 вирус сохраняется в молоке в течение 72 ч, то при pH 7,1 - только 48 ч (104). Снижение кислотности молозива до pH 4,5 не разрушает вирус в течение 2 ч, особенно при высоких исходных титрах, а в нативном молозиве вирус сохранялся в течение 18 дн при комнатной температуре (111). Прямой солнечный свет инактивирует ВЛКРС в течение 4 ч, УФ лучи - в течение 30 мин (120 Вт на расстоянии 1м). ВЛКРС полностью теряет активность в р-рах: натриевого щелока (0,5%, 30 мин, 22°С); этанола (2,0%, 4 ч, 22°С); формальдегида (0,5%, 8 ч, 37°С); фенола (0,5%, 72 ч, 4°С) (48). В жидком азоте лимфоциты, несущие провирусную ДНК, сохраняют инфекционность в течение нескольких лет. Повторное замораживание и оттаивание разрушает клетки и устраняет инфекционность.

Антигенная структура. Электрофорез очищенных вирионов ВЛКРС в SDS - ПААГ и гельфильтрация в присутствии гидрохлорида гуанидина показывают в составе вирионов 4 главных негликозилированных белка (р24, р15, р12, р10) и 2 гликозилированных белка (gp51 и gp30). Внутренние структурные белки: р24 был первым структурным белком, выделенным из инфицированных клеток или из очищенных вирионов. Белок нейтральный и умеренно гидрофобный; АГ активность сохраняется после обработки эфиром или после фиксации ацетоном. Установлена общая АГ детерминанта в главном внутреннем белке ВЛКРС и вируса лейкоза саркомы птиц, вирусов типа С млекопитающих (мышей, хомяков, обезьян) и вируса типа D ( вирус обезьян Мейзон-Пфайзера) (43). Между р24 ВБЛ и р24 вируса Т - клеточного лейкоза человека имеется статистически достоверная гомология (29). Сыворотки крови КРС с АТ против р12, р15 и р24 ВБЛ давали перекрестную реакцию в иммуноблоке только с р24 HTLV -1 (81). Р15 является слабым основным фосфопротеидом, не содержащим остатки метионина. Совокупность молекул р15 представлена 2-мя разновидностями: одни молекулы связаны с липидным слоем 2-слойной мембраны вируса, другие -

с вирусной РНК (116, 117). Р12- основной белок с высоким содержанием глицина и проли- на, что определяет низкий уровень вторичной организации белковой молекулы. Вирион тесно связан с вирусной РНК и имеет изоэлектрическую точку - 8,0 (117). Изучение аминокислотного состава р12 2-х изолятов ВБЛ выявило различие только в одной аминокислоте. Такой минимальный дрейф среди независимых изолятов дает дополнительное подтверждение гомологии, установленной между р12 ВБЛ и р15 HTLV (92).

РЮ - продукт расщепления одной из фракций р15, обладающей выраженными основными и гидрофобными свойствами, способными связываться с 1-нитевой ДНК (116). Фермент - обратная транскриптаза, является слабым антигеном. АТ к этому белку выявляют только у некоторых коров, естественно инфицированных ВЛКРС, независимо от концентрации в их сыворотке АТ против структурных вирусных белков. На структурные АГ ВЛКРС - белки pi5, р24, gp30 и gp51 в сыворотках крови больных коров обнаруживают КСА (38).

Главные гликопротеины (gp51 и gp30) обладают умеренно гидрофобными свойствами и входят в состав вирусной оболочки в виде комплекса 1:1, образованного дисульфидными связями. Они являются производными одного гликозилированного предшественника gpr72 (env) (79). По аналогии с другими представителями ретровирусов, ВЛКРС содержит трансмембранный белок, кодируемый геном env. Впервые выявленный рЗО отличается от gp30 и проявляет высокую гомологию с трансмембранными белками ретровирусов В и С типов, а так же с 3'-областью гена env вируса Т-клеточного лейкоза человека (109). МонАТ к gp 51 ВЛКРС взаимодействуют с 8 независимыми эпитопами на молекуле белка, из которых 3 эпитопа (F, G, Н) являются биологически активными, определяющими инфекционность вируса и способность вируспродуцирующих клеток формировать синтиций (49, 50, 80). С-айт Н служит рецептором-мишенью для КСА. Пространственное расположение эпитопов F, G, Н в молекуле АГ связано с гликозилированным фрагментом (15кД) (51). Удаление углеводных звеньев gp51 смесью гликозидаз приводит к снижению до минимума реактивности АГ с антисыворотками, полученными от коров и овец, инфицированных ВБЛ (108).

Антигенная вариабельность и родство. В АГ отношении ВЛКРС отличается от известных вирусов типа С. Не выявлено с помощью ИФ и иммунодиффузии АГ родства между главным внутренним белком ВЛКРС р24 и группоспецифическими АГ вирусов лейкозов мышей и кошек, опухолей молочных желёз мышей, вирусов бабуинов, Мезон-Пфайзера, шерстистых обезьян. ВЛКРС, являясь экзогенным ретровирусом КРС, отличается от известных ретровирусов по АГ свойствам, морфогенезу, способности индуцировать синцитий в монослойных культурах клеток и по свойствам ревертазы. Кроме того, в отличие от большинства других лейкемогенных вирусов, он присутствует у инфицированных животных в непродуктивном состоянии. На основании этих различий, Ferrer считает, что ВЛКРС является особым лейкемическим вирусом, принадлежащим к особой группе Oncovirinae, обозначенной как тип Е (54).

Локализация вируса, вирусоносительство, персистенция. ВЛКРС обнаруживается в клетках молозива и молока естественно заражённых животных. Из слюны, носовых истечений, мочи и спермы инфицированных животных его выделить не удалось. Экспериментально и спонтанно заражённый до или после рождения теленок остаётся инфицированным всю жизнь, несмотря на постоянное присутствие ВНА, выявляемых в РДП, РСК и других серологических реакциях (93). Отсутствие экспрессии генома ВЛКРС при наличии транскрипционных провирусов в опухолевых клетках дало возможность предположить, что причиной опухолевой трансформации клеток ВЛКРС является нарушение структуры клеточного генома (121). Неспособность АТ элиминировать ВЛКРС объясняется тем, что этот вирус обычно присутствует в инфицированных лимфоцитах в непродуктивном состоянии и защищён от действия АТ. Размножение его не является необходимым для распространения в популяции животных. Инфицированные лимфоидные клетки могут передавать вирусный геном потомству во время размножения клеток. От клетки вирус может передаваться также без продукции вирусных частиц с помощью механизма Cellular Kissing (клеточного прикосновения), как описано относительно герпесвирусной системы.

Антигенная активность. Инфицированные ВЛКРС животные вырабатывают АТ к нескольким вирионным АГ. Впервые для выявления АГ этого вируса в цитоплазме продуцирующих вирус лимфоцитов КРС был использован метод непрямой ИФ с использованием сыворотки больного лейкозом КРС. В дальнейшем было показано, что выявляемый этим методом АГ является вирионным компонентом, несущим АГ детерминанты, присутствующие в главном внутреннем вирионном белке р24. В сыоротке крови больных лейкозом коров обнаружены КСА, к 4-м вирусным полипептидам: р15, р24, ЕрЗО, и §р51. В сыворотке крови телят и ягнят, родившихся от больных лейкозом животных, имеется высокий уровень специфических АТ, сохраняющийся в течение 5-6 мес после рождения у телят и 3 мес у ягнят. Наличие высокого титра колостральных АТ способно нейтрализовать инфекцию ВЛКРС и предотвратить заражение новорожденных телят при условии их содержания раздельно от больных коров (39). АТ вырабатываются преимущественно на структурный белок §р51 и относятся к ^С, IgA и 1^*М. Наличие АТ не предотвращает развития опухолей.

Экспериментальная инфекция. Болезнь можно воспроизвести на новорождённых телятах и овцах при введении им различных вируссодержащих материалов. Экспериментальному лейкозу предшествует бессимптомная онковирусная инфекция, переходящая в последующем в гематологическую стадию болезни с развитием характерной клинической и патоморфологической картины. У заражённых животных гематологическая стадия характеризуется постоянным лейкоцитозом и лимфоцитозом. Воспроизведение лейкоза у овец осуществляется с большим постоянством и в более короткие сроки по сравнению с КРС. После внутриперитонеального, подкожного, внутримышечного введений нативных лейкоцитов, краткосрочных культур клеток лейкозной коровы и бесклеточных фильтратов культуральной жидкости этих культур у всех заражённых телят и овец через 15-90 дн, в зависимости от дозы и активности вводимых материалов, развивалась инфекция, выявляемая как серологическими, так и вирусологическими методами.

В условиях опыта животных можно заразить аэрозольно и интраназально.

Инфекцию ВЛКРС можно также воспроизвести на козах, однако без клинических признаков лейкоза. Введение ВЛКРС в организм шимпанзе сопро-вождалось образованием и длительной циркуляцией вирусспецифических АТ, однако выделить инфекционный вирус не удалось. Показана возможность пассирования вируса (шт. РЬК) через новорождённых ягнят. В 6-и последовательных пассажах прослежено изменение некоторых биологических свойств вируса: усиление его лейкозогенности и иммуносупрессивного действия, сокращение сроков индукции синтеза вирусспецифических АТ после инфицирования. Длительное выявление вирусспецифических АТ без клинических проявлений лейкоза наблюдается также у заражённых ВЛКРС кроликов и свиней. В экспериментальных условиях не установлен положительный эффект применения миксоферона (смесь антивирусных интерферонов, полученных генно-инженерным путем) (15,16,17).

Инфицирование ВЛКРС мышей, крыс, хомячков, морских свинок, собак, белок, кошек и птиц (цыплят, голубей) не сопровождается развитием лейкозного процесса или выработкой вирусспецифических АТ. Изучены свойства ВЛКРС на кроликах, трансгенных по гену анти- смысловой РНК (асРНК) ВЛКРС. Иммунный ответ на экспериментальное заражение ВЛКРС, выявляемым в серологических реакциях, наблюдали у одного из 4-х трансгенных и у 3-х из 4-х контрольных кроликов через 1-3 мес. Реизолировать ВЛКРС удалось от трех контрольных кроликов, тогда как от трансгенных кроликов вирус не выделяли (46). Кролики наиболее чувствительны при заражении их внутривенно нативными лейкоцитами (в дозе 50-100-106) от больной лейкозом коровы. (26). Кролики могут служить лабораторной моделью при изучении ВЛКРС. Через 28-35 дней после заражения опытные кролики и овцы продуцировали антивирусные АТ, выявляемые в РИД (13, 14, 15). В клетках нелимфоидного происхождения ни ВЛКРС, ни его АГ не обнаруживаются. С помощью молекулярной гибридизации показано, что в этих клетках отсутствуют последовательности ДНК провируса.

Культивирование. Вирус лейкоза впервые удалось обнаружить в краткосрочных культурах лимфоцитов крови инфицированных животных (84). ВЛКРС репродуцируется в перевиваемых хронически инфицированных культурах клеток тканей животных разных видов. Наибольшее распространение в мире получила перевиваемая линия клеток FLK-BLV, которую получил в 1974 г. Van der Maaten путём сокультивирования эмбриональных клеток почки овцы с лимфоцитами лейкозной коровы. Эта линия клеток используется для биохимических, морфологических и серологических исследований (110,119,120,122).

В настоящее время получены и широко используются перевиваемые хронически инфицированные ВЛКРС линии клеток: фибробласты легкого эмбриона коровы (АИД-15), почки эмбриона коровы (ПЭК); почки эмбриона овцы (FLK-BLV); легкого эмбриона летучей мыши (T61-Lu); легкого макаки-резус (BLV-Simian); селезенки овцы (FLS, J-1228); тимуса эмбриона коровы (ТЭК-МВА-766 LmTT) (50, 62, 120). Большинство экспериментальных работ по изучению структуры ВБЛ и биосинтеза вирусных компонентов выполнены с использованием культуры FLK-BLV (119, 120). Эта клеточная линия является лучшим продуцентом вируса; на одну клетку FLK-BLV в среднем приходится 600 копий вирусспецифической РНК. Позднее получена новая линия клеток FRK (fetal Ramb Kindey) - BRV (почка плода овцы и лимфоцитов), используемая для изучения морфологии ВЛКРС. В 1991 г получен новый штамм клеток почки эмбриона коровы Ml 18 ВСКК(П) для культивирования ВЛКРС и накопления вирусной биомассы с целью приготовления иммунодиагностических и профилактических препаратов (37).

Продукция вируса зависит от концентрации эмбриональной сыворотки в ростовой среде и снижение её с 10 до 5,0 или 2,5% приводит к снижению продукции вируса иа 40 и 80% соответственно. Усиление репродукции вируса наблюдали при добавлении в ростовую среду 20 мкг/мл инсулина. Добавление дексаметазона ингибирует репликацию и снижает выход вируса на 50%. ФГА, Кон-А и липополисахарид не оказывали заметного действия (108). Культивирование клеток FLK-BLV на микроносителях типа Цитолар или Cytodex повышает урожай вируса в 3-4 раза по сравнению с роллерным или стационарным режимами культивирования. Методом клонирования FLK-BLV получены сублинии, различающиеся по уровню продукции вируса (78). Репродукция вируса в 3 из 18 клонированных сублиний в стационарном режиме была на уровне родительской линии в роллерных установках. Рол- лерный режим позволяет значительно снизить расход среды : 10-кратное увеличение площади монослоя при 2-кратном увеличении расхода позволяет получить с 1 л культуральной среды до 2 мг gp51 ВЛКРС. Максимальный урожай вирусного АГ получен в культуре FLK- BLV, с использованием сыворотки крови лошади. Урожай вирусного АГ в культурах, выращенных на сыворотке крови безмолозивных телят, плодов коровы и коров был ниже и составил 0,189, 0,116 и 0,025 мг/мл соответственно (77).

В большинстве случаев с момента установления инфицирования клеток наблюдалось увеличение продукции вируса на протяжении нескольких начальных пассажей, затем продукция вируса снижалась или исчезала. Однако, клетки FLK и ТЭК-МВА-76 сохраняют репродукцию вируса на высоком уровне на протяжении многих пассажей (свыше 200). АТ против gp51 вируса, в отличие от АТ к g24, подавляют репликацию вируса в краткосрочных культурах лимфоцитов. Ингибирование экспрессии вирусного генома происходит только в том случае, если в ростовую среду добавляют плазму крови инфицированных животных (5). Именно она содержит фактор, блокирующий экспрессию вирусного генома в культуре лимфоцитов (115). Блокирующий фактор выявлен в плазме крови 16 из 23 инфицированных коров, и 2 из 17 свободных от ВБЛ коров (69). Ингибирующим действием на экспрессию вирусного генома обладали лизаты тромбоцитов крови, инфицированных и свободных от ВБЛ коров (114). Репликация ВЛКРС в культурах клеток не сопровождается деструкцией чувствительных клеток и не проявляется разрушением монослоя. Однако, в отличие от других известных ретровирусов ВЛКРС индуцирует образование синцитиев в монослойных культурах нетрансформированных клеток КРС, овец, коз, человека, обезьян и летучих мышей. Наиболее чувствительными клетками-мишенями являются монослойные культуры клеток селезенки эмбриона КРС на ранних пассажах. Инфицированные ВЛКРС клетки индуцируют формирование синцитиев в монослойных культурах клеток крыс, трансформированных вирусом саркомы Рауса (ХС-клетки), или в культурах клеток кошек, трансформированных вирусом саркомы мышей (СС81-клетки) (62). Бесклеточные препараты ВЛКРС также индуцируют образование синцитиев в чувствительных клетках. УФ-облучение, обработка ультразвуком, прогревание при 5 6° С в течение 30 мин, замораживание и оттаивание полностью инактивируют синцитийобразующую активность препаратов ВЛКРС. Для стимуляции продукции вируса лейкоза и его АГ в перевиваемых культурах клеток (РЬК-ВЬУ и ТЭК-МВА-76 ) рекомендован инсулин (22).

Способность ВЛКРС индуцировать в монослойных куьтурах клеток образование синцитиев (многоядерных клеток) была использована для разработки специфичного, чувствительного и быстрого диагностического теста для выявления инфекционного вируса и ВНА. Этот тест обеспечивает количественные результаты и успешно применяется для прямого выявления ВЛКРС - инфекции у КРС и животных других видов (23, 24, 25, 27, 28, 40, 41, 42, 44, 45,

66, 67).

Особенности репродукции. В краткосрочных культурах вирус накапливается преимущественно во внеклеточных пространствах, но может формировать и внутриклеточные скопления, заключенные в цитоплазматические вакуоли. Почкующиеся формы вирионов можно обнаружить через 3-9 ч культивирования. В нативных лимфоцитах крови больных животных вирионы ВЛКРС, как правило, обнаружить не удается. В перевиваемых культурах клеток почкующиеся формы вирионов встречаются чаще. Почкование вируса сопровождается значительной дистрофией цитоплазмы (8). Инфицированные ВЛКРС клетки индуцируют формирование синцития из клеток индикаторных культур. Каждый очаг синцития является результатом действия одной биологически активной инфекционной вирусной частицы и представлен поликариоцитом, образованным в результате слияния 5-25 клеток (68).

ГА свойства. ВЛКРС агглютинирует только эритроциты мышей. Максимальная Г А наблюдается при pH 6 и температуре 4°С. После обработки вируса тритоном Х100 или ультразвуком Г А активность вируса повышается в 6-16 раз. Обработка трипсином, КЮ4 или нейраминидазой значительно снижает ГА-активность ВЛКРС. Эти данные указывают на то, что ГА ВЛКРС является гликопротеином ?р51, который после очистки обладает высокой ГА- активностью. Обработка мышиных эритроцитов нейраминидазой в 4 раза повышает их способность агглютинироваться.

Г Ад свойства не установлены.