ГЕМОРРАГИЧЕСКАЯ БОЛЕЗНЬ КРОЛИКОВ

Распространение. Болезнь в 1984-1985 гг. была широко распространена в Китае. В бывшем СССР болезнь впервые зарегистрирована в 1986 г. среди кроликов приграничного с Китаем совхоза. Диагноз не был поставлен, кроликов убили, а шкурки отправили на фабрику Московской области. Вскоре болезнь широко распространилась по Московской области, затем была зарегистрирована в Воронежской, Липецкой, Саратовской областях, в Молдавии, на Украине. С 1988 г. ГБК регистрировали в Германии (ГДР и ФРГ), Чехословакии, Швейцарии, Франции, Болгарии (22,24).

В январе 1989 г. МЭБ приняло её официальное название “вирусная геморрагическая болезнь кроликов”. ГБК появилась в Мексике, Австралии, Польше, Испании, Югославии, в дальнейшем - в Португалии, Бельгии, Дании, Греции, Люксембурге, Нидерландах, Великобритании и других странах. В 1993 г. ГБК зарегистрирована на Кубе, в Ливане, Израиле. С 1990 г. ГБК регистрировали в Камеруне, Тунисе, Реюньоле, Ливии (1,2,3, За, 17а).

Клинические признаки и патологоанатомические изменения. Вначале заболевание описывали как заболевание зайцев - “синдром зайцев-русаков”, которое регистрируется в Европе с 1985 г. Обе инфекции очень похожи, однако между их возбудителями есть некоторые отличия. По данным европейских ученых, возбудитель ГБК относится к семейству Caliciviridae, однако ученые Китая и США считают его парвовирусом. Первое сообщение о вспышке геморрагической лихорадки кроликов поступило в 1987 г. из Словакии. Изучение ранее собранных сывороток кроликов показало, что подобный вирус циркулировал в стране уже давно, однако он обладал слабой патогенностью (35,36,39).

У кроликов инкубационный период болезни обычно продолжается 48-72 ч, иногда до 120 ч, при экспериментальном заражении (внутримышечно, подкожно) он может составлять ] 8-24 ч. Клинически болезнь почти не проявляется. Обычно внешне здоровые кролики делают несколько судорожных движений конечностями и погибают. Лишь у отдельных особей отмечали легкое угнетение, отсутствие аппетита и за 1-2 ч до гибели истечения из носа (желтые или кровянистые). Установлено, что за 32 ч до гибели у кроликов повышается температура тела до 40,8°С. Обычно при внешнем осмотре даже за несколько минут до гибели, трудно отличить больного ГБК кролика от других клинически здоровых. Бессимптомное течение болезни преобладало и у естественно инфицированных кроликов. Угнетение чаще всего наблюдали у беременных самок, которые иногда абортировали. Бессимптомное, молниеносное течение в естественных условиях преобладало, как правило, в начале эпизоотии, далее продолжительность болезни возрастала, процент гибели животных снижался.

Макроскопически наиболее значительные изменения отмечали в орга'нах дыхания. Легкие кровенаполнены, интенсивно отечны и неравномерно окрашены, у естественно больных кроликов имели серовато-розоватый цвет с единичными или множественными точечными и пятнистыми кровоизлияниями под плеврой. С поверхности разреза стекала красная или почти бесцветная жидкость, из бронхов при надавливании выделялся пенистый экссудат. Закономерностей в локализации патоморфологических изменений в какой-либо доле легкого (верхушечная, сердечная, диафрагмальная) не установили: поражались все доли сразу, либо та или иная часть. Стенки трахеи, носовых полостей, в меньшей степени гортани, были резко геморрагичны. Их красный цвет чаще был обусловлен венозной гиперемией, а не редкими кровоизлияниями. Просвет трахеи и гортани заполнен красноватой или бесцветной пенистой жидкостью. Шерсть вокруг носа у отдельных особей загрязнена кровянистыми истечениями.

Изменения в печени постоянны, но не всегда однотипны и обусловлены степенью ее кровенаполнения, что вызывало изменение цвета, объема и консистенции.

Патологоанатомические изменения в других органах выражены слабее и менее постоянны. В форме геморрагий их иногда находят в матке и надпочечниках, в половых органах, зобной железе, головном мозге. При патологоанатомическом исследовании погибших кроликов выявляли некротизирующий гепатит и геморрагический диатез (31).

Г истологически на первый план выступали нарушения гемоциркуляции, а в некоторых органах и некродистрофические изменения. По тяжести, постоянству и диагностической значимости гистологических изменений органы можно расположить следующим образом: печень, органы дыхания, почки, селезенка, сердце, головной мозг, тимус, другие органы.

У павших животных печень поражалась в 100% случаев. Первичные изменения (дистрофия и некроз отдельных клеток) появлялись в отличие от остальных органов уже через 12 ч после экспериментального заражения. Далее основным патологическим процессом в органе становился тотальный некроз и некробиоз гепатоцитов, они сморщивались, округлялись, теряли связь друг с другом, балочная структура нарушалась, либо полностью исчезала (дискомплектация). Ядра гепотацитов подвергались пикнозу или рексису, на их месте оставались практически утратившие базофильные свойства слабоокрашенные округлые образования. Часть печеночных клеток полностью теряла ядерную субстанцию и имела вид полиморфных эозинофильных глыбок. На фоне некротических изменений четко виднелись сравнительно малоизмененные желчные протоки. Их покровный эпителий сохранялся, но обычно отслаивался от окружающей его соединительной ткани, эпителий желчного пузыря обычно был некротизирован. Иногда, в основном у кроликов, павших в течение первых суток после заражения, некротические изменения были более выражены в перипортальной ткани почечных долек. Эти участки состояли из бесформенной эозинофильной массы, содержавшей множество фрагментов ядер разрушенных гепатитов и нейтрофилов (псевдо- эозинофилов). Гепатоциты, окружавшие центральные вены, находились в состоянии зернистой дистрофии; степень кровенаполнения органа варьировала: иногда печень была нафарширована эритроцитами, располагавшимися в значительно расширенных синусоидных капиллярах, либо содержала небольшое число красных кровяных телец преимущественно в крупных сосудах. Изменения в легких характеризовались отеком и диффузными, реже очаговыми кровоизлияниями. Большая часть альвеол, а иногда и бронхиолы с окружавшей их соединительной тканью, частично или полностью заполнены экссудатом, часто с примесью эритроцитов и макрофагов. Межальвеолярные перегородки набухшие, а в местах интенсивного отека и массовых геморрагий разрушены. Сосуды органа кровонаполнены, их стенки разрыхлены, иногда некротизированы. В просвете сосудов вместе с эритроцитами присутствовала оптически плотная, резко эозинофильная масса, тесно прилегавшая к эндотелию.

Патология почек состояла из нарушения микроциркуляции и процессов некродистрофи- ческого характера и затрагивала корковый и мозговой слои. Сосудистые клубочки обычно разрушены и представляли собой скопления эритроцитов с примесью ядер эндотелия и моноцитов, ограниченных капсулой Шумлянского-Боумена. Геморрагии разной интенсивности имелись в интерстиции и просвете почечных канальцев, эпителий последних находился в состоянии зернистой дистрофии и некроза, иногда полностью лизирован, расширенный просвет канальцев заполняли оксифильные цилиндры. В селезенке наблюдали практически полное отсутствие форменных элементов крови, отек ретикулярного каркаса ярко выражен. Ретикулярная ткань обнажена, набухшая, многочисленные синусоиды заполняла отечная жидкость, содержавшая лизированные эритроциты, единичные плазм оциты и лимфоциты (последние в относительно больших количествах сохранялись лишь в белой пульпе). Миокард находился в состоянии зернистой дистрофии, сердечные сосуды кровонаполнены, соединительная ткань отечна, иногда пронизана эритроцитами. Идентичные нарушения гемодинамики возникали в тимусе и лимфоузлах (1). Изменения в других органах, кроме головного мозга, где довольно часто отмечали негнойный энцефалит, не были стабильны и существенного значения в патологии болезни не имели.

Патогенез. Исследования позволили сделать вывод, что тяжелые поражения печени - основной момент в патогенезе ГБК, чем и объясняется её скоротечность и летальный исход. В данном органе раньше, чем в других, и в наибольшем титре (1:4096) накапливался возбудитель и развивался патологический процесс. Появлявшиеся в других органах на заключительном этапе развития болезни патологические изменения (расстройства гемодинамики, некродистрофические процессы) - результат резкого нарушения функции печени. Развивавшиеся в предагональном состоянии глубокие нарушения микроциркуляцни в легких в форме отека - главная причина гибели животных. Через 30 ч после заражения кроликов вирусом ГБК обнаружены признаки диссеминированного внугрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром) - удлинение одностороннего протромбинового времени, понижение факторов V, VII и X, и увеличения уровней растворимых фибрин-мономерных комплексов и Д- димеров. Обнаружено снижение числа тромбоцитов, гетерофилов и лимфоцитов. Тесная связь ДВС-синдрома и некротического гепатита подтверждает, что повреждение печени может быть наиболее важным “запускающим” фактором ДВС-синдрома (34).

ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Возбудитель ГБК - РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству калицивирусов. Размер вириона 28-33 нм. Вирус кубической симметрии, имеет форму икосаэдра, электронноплотное ядро (20 нм). Величина вирусной РНК составляет примерно 8000 оснований (32).

Вирулентность возбудителя ГБК чрезвычайно высока. В печени и шкурках кроликов, погибших при экспериментальном заражении, вирус накапливается в титрах ю4,5"5,0 ЛД50, а в почках, лёгких, мышцах, лимфоузлах - ю1,0'2,0 ЛД50.

Морфология и химический состав. Плавучая плотность полных вирионов составляет 1,36, полупустых - 1,32 и пустых - 1,31 г/мл. Вирионы содержат 17+4% РНК ехЕ2ад™ = 4,3+0,7 см2/мг. Выявлен основной белок с мол.м. 65 кД и небольшое количество белка с мол.м. 67 кД, который взаимодействует с поли-АТ кролика. Мол.м. вируса 15 + 4 МД (28). При фракционировании очищенных препаратов вируса в SDS-PAGE найдено 14 вирусных протеинов, из которых 3 (61к, 38к и 52к) являются мажорными протеинами (33). Вирионы представляют собой полые икосаэдральные частицы диаметром 30 нм, не имеющие оболочки. Геном представлен полиаденилированной РНК, синтезирующей in vitro вирусный полипептид с мол.м. 60 кД. С помощью кДНК клонировано по крайней мере половина вирусного генома (37). В капсидах вируса 180 субъединиц, формирующих пентамер-гексамеры, 4 ви- рионных белка - VP1, VP2, VP3 и VP4 мол.м. 60-61, 54,7, 52 и 26-28кД соответственно. VP1 - основной капсидный белок, на долю которого приходится 54,7% массы капсидных белков (24,32). Синтезирован белок VP60. Эго уникальный компонент капсида ВГБК.

В 1992 г. Zecheng и соавт. (42) высказали предположение о том, что ВГБК относится к семейству парвовирусов. Однако в настоящее время общепризнано, что возбудитель ГБК относится к семейству калицивируов. Вирус лишен оболочки, обладает триангуляционным числом равным 3. Диаметр вирионов 33-37 нм. Капсид состоит из 32 капсомеров с наружным диаметром около 9 нм. После центрифугирования в градиенте сахарозы идентифицировано 2 типа вирусных частиц с разными коэффициентами седиментации - 130 и 160S. Выявлено 4 вирионных белка с мол.м. 66,4 65, 63,5 и 41кД. Геном вируса ГБК обладает 1- нитевой РНК с мол.м. 2,1 кД (42). Он содержит приблизительно 7,6 тыс. нуклеотидов. С помощью компьютерной программы “RNA Faid” проанализировали 3' концевые некодирующие последовательности пяти калицивирусов кошек (FCV), вируса ГБК (RYDV) и двух вирусов морского льва San miguel (SMSV). Оказалось, что 3' конце вые последовательности FCV содержали 40-46 нуклеотидов и имеют гомологию 72-91%. Сходство между двумя изо- лятами SMSV составило 75% (39). Капсидный белок вируса ГБК экспрессируется в клетках насекомых либо в виде отдельного белка, либо как часть липопротеина, включающего вирусную ЗС-подобную протеазу и РНК-полимеразу. Оба способа экспрессии приводят к сборке частиц, которые морфологически и АГ-подобны очищенным вирионам (38).

Устойчивость. Вирус ГБК устойчив к обработке эфиром, хлороформом, к pH 3 и 50°С в течение 60 мин. Он сохраняется в суспензии инфицированной печени при температуре 4°С в течение года, инактивируется 0,1%-ным р-ром формалина или теотропина при температурах 4°, 27°, 37°С в течение суток. Сохраняется без снижения вирулентности при - 40-50°С более 5 лет. Оказался чувствительным к формалину, глутаровому альдегиду. С учетом этих данных Шевченко и соавт. (15, 17, 17а) разработали методы дезинфекции шкурок кролика при ГБК. Препарат глианол или глутаровый альдегид в процессе отмочки шкурок с добавлением поверхностно активных веществ (в частности неонола) и уксусной кислоты по определенным режимам инактивирует вирус ГБК, содержащийся в инфицированных или конта- минированных шкурках кроликов. Рекомендован в практику и метод дезинфекции шкурок формалином в процессе пикелевания.

Культивирование. Вирус ГБК по свойствам напоминает калицивирусов, но имеет и отличия. Вирус реплицируется в клетках кроликов только in vivo (7). По данным других исследователей, он так же репродуцируется в перевиваемой культуре клеток почки кролика. Культуральный вирус 5-, 10- и 16-го пассажей вызывал у кроликов типичную ГБК. На поздней стадии инфекции как зрелые, так и незрелые вирионы обнаруживались в цитоплазме и часто долго ассоциировались с клеткой; выделение вируса происходит после лизиса по следней. Специфический АГ сначала появлялся в ядрах инфицированных клеток, а затем часто в цитоплазме (25). Полевой изолят вируса ГБК размножался в перевиваемой линии клеток почки кролика (ОЖК) и вызывал ЦПД после 2-х пассажей (23).

Гемагглютинирующие свойства. ГА-активность вируса ГБК связана с цельными ви- рионами (9). Суспензия из печени, селезенки, легких инфицированных животных агглютинирует эритроциты овец, птиц и человека. Наилучшие результаты получены с эритроцитами человека 0 (1) группы. Возбудитель болезни зайцев агглютинирует эритроциты группы О человека (30). У больных кроликов вирусный ГА-антиген выявлялся в моче и конъюнктивальных смывах, а у погибших - в крови, печени, селезенке, тимусе, сердце, а иногда также в мозге, скелетных мышцах и подчелюстных лимфоузлах. Наличие гемагглютинации коррелировало с присутствием вирусной РНК.

Антигенная вариабельность и родство. Вирус способен вызвать образование АТ в организме животного: ВНА, КСА, анти-ГА и др., которые можно выявлять с помощью соответствующих реакций через 4-5 дн после вакцинации кроликов. Методом гибридизации у вируса ГБК выявлена определенная гомология с вирусом Н-1, мелким вирусом мышей, пар- вовирусом свиней и парвовирусом гусей (24). Между ВГБК и возбудителем “синдрома европейских зайцев” установлено антигенное родство, подтверждением которого служат следующие факторы: контакт суспензии печени зайцев с антисывороткой к ВГБК четко снижал патогенность инокулята.

Экспериментальная инфекция. Суспензией из печени павших кроликов заражали внутримышечно и интраназально здоровых кроликов. В результате развивались характерные поражения (30). В ряде случаев кровь не свертывалась в течение нескольких часов, а при вскрытии органов (сердце, легкие, печень, почки) изливалась в больших объемах в полости (17а). При экспериментальном заражении инкубационный период составлял 12-72 ч. Накопление вируса в кишечнике через 4В ч составляло 4-4,5^ ЛД50/Г. Наибольшее накопление вируса происходит в печени экспериментально зараженных кроликов через 48-72 ч после заражения (титр ГА 1:512-1:8192) (4). Изучено сочетанное действие на кроликов гамма- лучей и вируса ГБК (10).

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Источники и пути передачи возбудителя. Способов передачи возбудителя инфекции известно несколько. В данном случае можно исключить трансмиссивный, так как сезонность болезни преимущественно осенне-зимняя. Насекомые при этом не играют роли. Аналогичная сезонность отмечена и в Китае, и в ряде других зарубежных стран. Передача возбудителя с кормами имеет место, но она не сопровождается таким быстрым распространением болезни по всей стране. Респираторный способ передачи, несомненно, имеет значение при распространении возбудителя внутри хозяйства, способствуя быстрому перезаражению всех животных, но мало вероятен перенос возбудителя по воздуху на тысячи километров для передачи из одного хозяйства в другое. Внутриутробный способ передачи вируса не изучен.

Эпизоотологии ГБК присущи характерные особенности. К возбудителю оказались чувствительными только кролики независимо от породы и пола. Наиболее чувствительны взрослые, массой 3-3,5 кг. Отмечено, что в начале эпизоотии ГБК первыми начинают болеть взрослые особи, затем поражаются кролики всех возрастных групп, за исключением подсосного молодняка. Летальность достигает практически 100%, в дальнейшем она несколько снижается и составляет 75-80%. Источник возбудителя - больные и переболевшие кролики. Факторами передачи могут быть корма, подстилка, навоз, почва, вода, инфицированные больными кроликами, а также пух и шкурки от больных животных и изделия из мехового сырья, поступившие из неблагополучных по ГБК пунктов. При этом вирус может сохраняться в шкурках в течение 3-х мес (17а). Выдвинут проект использования калицивиру- са кроликов для снижения численности европейских кроликов, которые вызывают эрозию почвы и представляют опасность для местных видов растений и животных. Вирус не представляет опасности для домашних животных и других видов местной фауны (18).

ДИАГНОСТИКА

Диагноз на ГБК ставят на основании эпизоотологических, клинических, патоморфологических данных и результатов лабораторных исследований. При эпизоотологическом обследовании обращают внимание на обшую эпизоотическую обстановку в хозяйстве, районе, состояние вакцииопрофилактики, условий содержания и кормления кроликов. Из специфических факторов учитывают следующее, массовую внезапную гибель кроликов, в основном взрослых; невосприимчивость крольчат; быстрое распространение болезни и широкий охват поголовья; животные других видов не болеют. На первых этапах эпизоотии болезнь обычно протекает молниеносно, без клинического проявления.

Лабораторную диагностику ГБК проводят в специализированных лабораториях. Порядок диагностических исследований и постановка окончательного диагноза выполняют по следующей схеме: ЭПИЗООТИЧЕСКИЙ ОЧАГ ; ОТБОР ПРОБ И ИХ ДОСТАВКА & 3 ч) ; ПОДГОТОВКА ПРОБ К ИССЛЕДОВАНИЮ И ПОСТАНОВКА РЕАКЦИЙ (РДСК, РГА, ИФА) ( 3-5 ч) - ОКОНЧАТЕЛЬНЫЙ ДИАГНОЗ.

Отбор и подготовка проб. При подозрении на ГБК в лабораторию посылают свежие трупы кроликов или паренхиматозные органы, (лучше печень). Вскрытие трупов проводят не позже чем через 2-3 ч после гибели животного.

Экспресс-методы диагностики. Разработан двойной антительный “сэндвич” ИФА (ДАС-ИФА) для выявления АТ в сыворотке крови кроликов. Чувствительность ИФА значительно превышает чувствительность РГА и РЗГА. Высокая чувствительность и специфичность предложенного метода на основе монАТ позволяет рекомендовать его как для обнаружения вирусного АГ, так и для ретроспективной диагностики болезни (8). Серологически (при электронной микроскопии) установлено сходство вируса ГБК с калицивирусом (40). В Китае испытывались в сравнительном аспекте 3 метода экспресс-диагностики гемораггиче- ской болезни кроликов: иммунопероксидазного окрашивания (I), точечного ИФА (II) и непрямой ИФ (III). При тестировании образцов печени у 17 экспериментально инфицированных кроликов установили, что чувствительность I - составляла 88,2%, II - 88,2 и III- 93,3 %.. При этом все 3 метода характеризовались 100%-ной специфичностью (29).

Индикация антигена вируса ГБК

РДСК. РДСК, разработанную во ВНИИВВиМ для диагностики ГБК, можно применять в 2-х вариантах: макровариант в пробирках и микровариант в панелях из оргстекла или по- листерола. В качестве компонентов диагностического набора используют сыворотки крови гипериммунизированных кроликов. Титры сывороток в РДСК должны быть не ниже 1:32 - 1:64. В качестве контроля используют сыворотку крови клинически здорового кролика, нормальный АГ (суспензия печени клинически здорового кролика). Постановку РДСК проводят при температуре 4-6 °С в течение 16-18 ч, а затем добавляют гемолитическую систему и помещают в водяную баню при температуре 37-38 °С на 15 - 20 мин. Результаты реакции считают положительными на ГБК при задержке гемолиза на 3 креста при разведении испытуемой сыворотки или АГ не менее чем 1:8.

РГА и РЗГА. Постановка этих реакций возможна с использованием набора ВНИИВВиМ микрометодом в пластинах с V- или U-образными лунками. Диагностическим титром испытуемой сыворотки считается разведение её ие ниже 1:64. В положительных сыворотках он достигает величин 1:128 и выше.

ИФА. В состав набора входят: специфические к вирусу ГБК IgG; специфический имму- нопероксидазный конъюгат; специфический органный неинфекционный АГ; контрольный > (нормальный) АГ; 10-кратный концентрат стандартизованного физиологического раствора; » 10-кратный концентрат трнсбуфера; 4-кратный концентрат цитратно-фосфатного буфера; : ортофенилендиамин; 30%-ная перекись водорода; казеин. Реакцию проводят в 96-луночных ; пластинах, которые предварительно сенсибилизируют специфическими IgG 2 ч при 37°С или в течение 18 ч при 4°С. Сенсибилизированные пластины можно готовить заранее и хранить при 4-6°С в течение 2-х недель. Постановка ИФА занимает не более 3-3,5 ч. Положительный диагноз на ГБК ставят на основании результатов исследования патматериала в двух реакциях : РГА и РДСК, или РГА и ИФА. Обнаружение специфического АГ в одной из указанных пар реакций является достоверным доказательством для постановки диагноза на ГБК (3, За, 5,17а,). Получены и использованы в непрямой ИФА монАТ. Разработана имму- ногистологическая диагностика ГБК (41).

Дифференциальный диагноз. ГБК необходимо дифференцировать от пастереллеза, сальмонеллеза, колибактериоза, оспы, миксоматоза, эймерноза, отравления, солнечного и теплового удара (17а).

С помощью РГА и иммуноэлектронной микроскопии удается дифференцировать ГБК и синдром европейских коричневых зайцев. С применением монАТ, специфичных к вирусу ГБК, разработан метод дифференциальной диагностики 2-х вирусов (21).