Лабораторная работа N° 13. ЛИЗОЦИМНЫЙМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯВОДНЫХ БИОЦЕНОЗОВ (Методика разработана Г. Н. Соловых)

Микроценозы — структурная единица экосистемы и информативная диагностическая компонента биоты, которая в силу высокой адаптации быстро реагирует на смену экологических условий, меняя свою функциональную активность по количественным и качественным параметрам, что важно для оценки состояния водных биоценозов.
В водной среде регистрируется широкий спектр организмов, обладающих лизоцимной* активностью и играющих значительную роль в самоочищении водоема.
Однако при поступлении промышленно-бытовых стоков в воду происходит селективный отбор штаммов, обладающих антилизо- цимным признаком, обеспечивающим им преимущество в заполнении экологических ниш в водоеме. Микроорганизмы, формирующие водные биоценозы, образуют функциональную систему «лизоцим — антилизоцим».
В биоиндикации антропогенного загрязнения водоема широкое распространение получили микробиологические методы, основанные на учете числа сапрофитных бактерий, выращенных на МПА, а также с помощью весьма распространенного метода оценки на основании коли-титра и коли-индекса. Наиболее надежно качество воды и состояние водного биоценоза характеризуется оценкой их с гидробиологических позиций, т. е. оценкой «откликов» на антропогенные воздействия всех компонентов биоты:
"Лизоцим — мурамидаза, фермент класса гидролаз. Катализирует гидролиз гликозидных связей между остатками аминосахаров N-антиглюкозамина и N- ацетилмурамовой кислоты в полисахаридных цепях муреинов (гетерополисаха- Ридных стенок бактериальных клеток), что ведет к разрушению оболочки бактериальной клетки. Обнаружен у фагов, бактерий, растений, животных. В организме лизоцим выполняет функцию неспецифического антибактериального барьера.
фито-, зоопланктона и бентоса. Однако все предлагаемые методы не лишены целого ряда недостатков. Это в первую очередь длительность и трудоемкость обработки взятых проб, а значит, низкая оперативность в регистрации антропогенного воздействия, а также регистрация уже состоявшегося изменения в биоценозе, а не предсказание его начала.
В основу принципа метода, предлагаемого в лабораторной работе, положена система «лизоцим — антилизоцим» микроорганизмов, которая образует функциональную систему «лизоцим (ЛА) —
антилизоцим (АЛА)» в биоценозе: ЛА бактерии               > АЛА
бактерии.
Исследования показали, что такая система чутко реагирует на антропогенные воздействия и может быть использована для биоиндикации ранних изменений в водоеме. Исходя из сказанного, в основу метода взято определение микробиологического индекса «Л», основанное на изучении количественных и качественных различий микроорганизмов, обладающих лизоцимным (ЛА) и антилизоцимным (АЛА) признаками. Полученный показатель позволяет выявлять ранние нарушения в состоянии водных биоценозов. При условии Л gt; 1, прогнозируется хорошее состояние биоценозов, при Л lt; 1 оно ухудшается.
Правила отбора проб для анализа следующие. Пробы отбирают в любой точке обследуемого водоема. Однако для полной биологической оценки водоема рекомендуется отбирать пробы в каждой точке батометром Молчанова с трех горизонтов: поверхность, середина и дно. Пробы сливают по 50 мл в одну стерильную колбу, тщательно перемешивают, в результате чего получается интегрированная проба воды, которую используют для анализа. При мониторинге рек отбор проб производят в трех точках одного створа (поперечного сечения реки): на правом берегу, левом и в середине реки.
Оборудование, материалы и реактивы:
стерильные чашки Петри; пробирки, пипетки на 1 мл, 5 мл, 10 мл; спиртовка; микробиологическая петля; этиловый 96%-й спирт; 1,5- и 0,7%-й МПА; суточная культура Micrococcus lysodecticus, штамм № 2665 (ГНСК им Л.АТарасевича); сухой яичный лизоцим; стерильная дистиллированная вода; хлороформ; исследуемая вода водоема.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Приготовить взвесь микрококка (одномиллиардную взвесь по стандарту мутности). Приготовить раствор лизоцима в концентрации 5 мкг/мл. Произвести разведение посевного материала (воды исследуемого водоема) до 10~2 и этот материал использовать для посева. Провести посев микрофлоры из воды с целью выявления лизоцимактивных бактерий. Для этого расплавить 1,5%-й МПА. В чашки Петри добавить 0,2 мл посевного материала и 0,2 мл одномиллиардной взвеси суточной культуры Micrococcus lysodecticus. Затем добавить примерно 10—20 мл расплавленного и охлажденного до 45—50 °С 1,5%-го питательного агара. Содержимое чашки тщательно перемешать на горизонтальной поверхности стола по часовой и против часовой стрелки, не отрывая чашку от поверхности. Дать агару застыть. Чашки перевернуть. Инкубировать 24 ч в термостате при 37 °С. Затем учитывать те колонии микроорганизмов, которые образовали вокруг себя зоны лизиса микрококка. Полученное число колоний дает нам величину М! — число лизоцимактивных колоний (ЛА). Провести посев из воды с целью определения антилизоцим- ных микроорганизмов. Для этого расплавить 1,5%-й МПА. В стерильную чашку Петри влить 1 мл раствора лизоцима (5 мкг/мл) и 0,2 мл посевного материала (воды водоемов в разведении 10-2). Залить примерно 10 мл 1,5%-го питательного агара, тщательно перемешать круговыми движениями на поверхности стола. Дать среде застыть. Чашки перевернуть. Инкубировать 24 ч при 37 °С. Через сутки выросшие колонии убить хлороформом. Для этого фильтровальную бумагу положить на крышку чашки Петри и налить сверху несколько капель хлороформа. Накрыть крышку чашкой с посевом на 20 мин. По истечении этого времени крышку с хлороформом снять и залить посев сверху 5 —10 мл расплавленного и охлажденного до 45 — 50 °С 0,7%-го МПА, добавить 0,2 мл микрококка в концентрации 109, тщательно перемешать, закрыть стерильно крышкой, дать среде подсохнуть. Перевернуть чашки и инкубировать 24 ч при 37 °С. Произвести после инкубации учет тех колоний микроорганизмов, вокруг которых и над которыми отмечаются зоны роста микрококка. Это и будет число антилизоцимактивных форм бактерий — М2 (количество АЛА форм.). Использовать полученные данные для подсчета показателя экологического состояния биоценозов — Л.
Оценку и прогнозирование состояния биоценоза делают по
тт М,(ЛА) соотношению: Л = ———
М2(АЛА)
где М, — число лизоцимактивных микроорганизмов; М2 — число антилизоцимактивных микроорганизмов в исследуемой пробе воды.

10. Дать характеристику экологического состояния биоценоза по соотношению

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бурдин К. С. Основы биологического мониторинга. — М.: Изд-во МГУ, 1985.
Бухарин О. В. Антилизоцимный признак бактерий и перспективы его практического использования // Персестенция микроорганизмов. — Куйбышев: КМИ, 1987.
Бухарин О. В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов / О. В. Бухарин [и др.] // Микробиология, эпидемиология и иммунология, 1984. — N° 2.
Соловых Г. Н. Метод выделения и учета антилизоцимактивных бактерий из воды природных водоемов / Г. Н. Соловых [и др.] // Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины, 1992. — Т. XXIX.
Соловых Г. Н., Бухарин О. В., Немцева Н.В. Патент РФ N° 2052815, 1996.
Теннер Е. 3. Практикум по микробиологии / Е. З.Теппер [и др.]. — М.: Колос, 1993.


 

Еще по теме Лабораторная работа N° 13. ЛИЗОЦИМНЫЙМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯВОДНЫХ БИОЦЕНОЗОВ (Методика разработана Г. Н. Соловых):

1. 4.6. Методики, разработанные А. В. Крушинским для изучения способности животных к поиску приманки, исчезающей из поля зрения
2. Использование разработанных подходов и методовдля экологической оценки микробныхсообществ наземных экосистем
3.   Количественное определение афлатоксинов В( и G( в кормах. Метод разработан Н. А. Соболевой.  
4. МЕТОДИКА ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ГИДРОМЕЛИОРАЦИИНА СУХОДОЛЬНЫЕ НАСАЖДЕНИЯ
5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЦЕНОЗОВ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ
6.   ГЛАВА 3 ЛАБОРАТОРНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ
7. 2.11.3. Значение работ ЭТОАОГОВ для оценки рассудочной деятельности животных
8.   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с., 2004
9.   МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА  
10. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА  
11.   ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КОРМОВ  
12. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА