3.10. Токсикологическая оценка лекарственных средств, кормодобавок, пестицидов и др., применяемых в ветеринарии

Токсичность вещества определяется как его способность причинять вред живому организму. Задачей токсикологических исследований является определение степени опасности при однократном и многократном применении.

Определение острой токсичности предусматривает проведение токсикомет- рической оценки и изучение симптомокомплекса интоксикации при однократном поступлении препарата в организм. Введение препарата животным производится тем способом, который предусмотрен для применения его в ветеринарии и животноводстве. Рекомендуется также определить токсичность и при других способах введения.

При исследовании нового препарата известной фармакологической группы токсичность его определяют в сравнении с токсичностью известного химического соединения (базовый вариант) не менее, чем на 2-х видах лабораторных животных. Токсичность препарата новой группы дополнительно устанавливают на том виде животных, для которых он предназначен.

В опытах используют клинически здоровых животных, ранее не подвергавшихся токсическому воздействию: белых мышей массой 18-20 г, белых крыс 180-200 г. и кроликов 2000-2200 г.

Исследуемое вещество вводят натощак, после 12-часовой голодной выдержки животных. Существует определенный набор методов и способов введения препаратов, причем для каждого из них устанавливается максимально допустимый объем вводимого раствора, эмульсии или водной взвеси (табл.15).

Таблица 15

Максимально допустимые объемы растворов при различных способах введе

ния препаратов лабораторным животным.

В зависимости от физико-химических свойств нового препарата, его назначения и показаний к применению, токсикологические исследования могут быть выполнены на морских свинках, кошках и собаках.

Основным способом при изучении острой токсичности препаратов является введение испытуемого вещества непосредственно в желудок. Для этого используют обычный медицинский шприц типа "Рекорд" объемом 1,0-20,0 мл или шприц "Жанэ" на 100 мл в зависимости от количества вводимого раствора. При введении кроликам удобнее использовать зевник с отверстием, через которое пропускают резиновый катетер длиной около 40 см и диаметром 4-6 мм. Мелким грызунам препарат вводят непосредственно через металлический зонд, в качестве которого используют обычный молочный катетер (белым крысам) или обрезанную и отшлифованную с напоем олова инъекционную иглу (белые мыши). При введении препарата животных фиксируют в вертикальном положении с незначительно запрокинутой головой и осторожно легкими вращениями вводят зонд в желудок. Раствор вводят медленно. Корм животным дают через 2-3 часа с момента введения.

Для растворения препарата чаще всего используют прокипяченную и отстоявшуюся воду комнатной температуры, при плохой растворимости - подсолнечное или другое растительное масло, реже другие растворители с учетом их физиологической совместимости. Выбор растворителя производят в поисковых опытах, где изучают степень растворимости данного препарата в водных, масляных и спиртовых растворах (вес. %). Нерастворимые вещест-

193

ва вводят в желудок в виде эмульсии или суспензии. В качестве эмульгатора используют яичный желток, которым эмульгируют растительное масло с последующим разбавлением смеси водой до нужной концентрации. Количество введенного раствора или эмульсии должно быть адекватным дозе и объёму.

Приготовление эмульсии. Берут 5 г растительного масла и прибавляют 7,5 г яичного желтка, освобожденного от белка. Предварительно желток тщательно растирают в ступке с навеской исследуемого вещества и затем по каплям при постоянном помешивании добавляют растительное масло и далее воду до заданного объема.

Определение острой токсичности, помимо принудительного введения препарата в желудок, можно также проводить методом свободного скармливания в смеси с излюбленным кормом. Данный метод приемлем том случае, если вещество не ухудшает вкусовых качеств корма и охотно поедается лабораторными животными. Необходимым условием для правильной оценки результатов острого опыта данным способом является полнота поедания всей порции приготовленного корма и индивидуальное скармливание расчетных доз животных. В качестве основы для смешивания можно рекомендовать комбикорма в количестве суточной нормы для каждого вида животного. Для улучшения вкусовых качеств в него можно добавлять в небольших количествах (5-7%) подсолнечный жмых или поджаренные и измельченные семена подсолнуха.

В токсикологическом эксперименте для испытания каждой дозы используют группу лабораторных животных, состоящую из 8-10 особей обоего пола (по 4-6 голов самцов и самок) с одинаковой массой тела. Испытуемые дозы препарата рассчитывают в мг на кг массы тела животного. Дозы эффек

ходят минимально токсическую дозу, которая не вызывает гибели (ЛД0).

Отправным моментом для поиска доз могут служить известные данные по острой токсичности аналогичных соединений. Далее увеличивают дозы пока одна из них не окажется достаточно высокой, чтобы вызвать гибель всех животных в группе (ЛД10о). Интервал между дозами лучше увеличивать с постоянной кратностью.

На животных каждой группы испытывают одну отдельную дозу препарата. Продолжительность наблюдения за состоянием здоровья животных составляет не менее 21 дня после затравки. В этот период учитывают внешний вид и поведение животных, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение к пище и воде, подвижность, ритм и частоту дыхания и сердцебиения. Обращают внимание на время возникновения и характер интоксикации, оценивают ее тяжесть, обратимость определяют сроки гибели животных. Учитывают общее состояние и поведение животных (аппетит, возбуждение или угнетение), изменение реакции на внешние раздражители, определяют тактильную, болевую и температурную чувствительность, температуру и массу тела животных. Отмечают клинические симптомы интоксикации, количество заболевших и павших особей, сроки наступления их гибели.

Отработку летальных доз на каждом виде лабораторных животных следует проводить одновременно и в максимально короткие сроки (2-3 недели) при одинаковых условиях кормления и содержания.

Данные экспериментальных исследований в первоначальном варианте выражают в виде процента (%) летальных исходов, представляющего с бой отношение числа погибших особей в каждой группе к общему числу животных в группе, умноженное на 100. Для оценки токсического действия препаратов в токсикологии принято определять летальные или смертельные дозы (ЛД), представляющие собой количество вещества, вызывающее гибель определенного количества животных, выраженного в процентах. Различают ЛД0 (минимальную токсическую дозу), ЛД16, ЛД50 (среднесмертельную дозу), ЛД84 и ЛД100 (абсолютную смертельную дозу). Следует помнить, что ве

личины ЛД0 и ЛД100 не являются статическими и поэтому могут варьировать в значительных пределах.

Для расчетов параметров токсичности и среднесмертельной дозы используют графические и статистические методы анализа. Существуют методы расчета по Беренсу, Керберу и Першину.

Расчет среднесмертельной дозы на примере диаммоний-фосфата по Беренсу.

Накопленные частоты вычисляются из суммы двух соседних цифр. Процент павших вычисляется из накопленных частот: сумма павших и выживших - за 100%, а число павших - х. + 25 = 27 -100% - х%

2х100 „ ^

х =              = 7.4%

27

Из таблицы вычисляем по Беренсу ЛД50:

тттт Л (50 - а) х d ЛД50 = А + ————, где Б - d

А - доза вызывающая а % смертельных исходов, причем аlt;50%;

Б - процент дозы, вызывающий число летальных исходов больше 50%; d - интервал или разница между дозами.

ЛД50 = 4000 + (50 26) х 1000 = 4000 + 501 = 4501мг/кг 50              73,9              -              28

ЛД50 можно вычислить и по Керберу:

ЛД50 = ЛД|00 - ?(Z х D), где

n

Z - средняя арифметическая из n особей у которых наблюдается эффект (т.е. смежные - две цифры в графе «Пало, гол» складывается и делится пополам).

d - интервал (разница) между дозами.

Например,

гттт о1000+ 3000+ 4500+ 5500+ 7000+ 9000              ,

ЛД50 = 8000              —              = 8000-3000= 5000(мг/кг)

ЛД50 = 5000 мг/кг

Средняя ошибка средней дозы эффекта определяется по формуле:

л/гт^              VK х E х d

MEd50 =              , где

n

К - постоянный множитель - 0,66;

Е - основное отклонение, определяемое как, полуразность % х (ЛД84-

ЛД16);

d - интервал между дозами. 66 х 1540 х 1000              /

MEd50 = J—              = V101640 = ±318,6

10

ЛД16 = 3000 + 1000 х(6 7,4) = 3000 + 462 = 3463 (мг/кг) 16              16 - 7,4

ЛД 84 = 6000 + 1000 х(84 - 73,9) = 6000 + 543 = 6543 (мг/кг) 84              92,5 - 73,9

ЛД50= 5000 ± 318,6

Т.о., средняя величина считается достоверной, если она превышает ошибку больше, чем в 3 раза.

Наряду со смертельной дозой устанавливают пороговую дозу - минимальное количество препарата, при котором наступает определенный статический достоверный сдвиг какого-нибудь чувствительного интегрального или специфического показателя у 50% опытных животных (например, понижение активности холинэстеразы). Расчет пороговой дозы проводят так же, как расчет ЛД50.

После определения величины ЛД50 и пороговой дозы вычисляют зону токсического действия, представляющую собой отношение ЛД50 к пороговой дозе. Чем меньше зона токсического действия, тем большую опасность может представлять собой данное вещество или препарат. Различают очень узкую зону (коэффициент меньше 6), узкую зону (коэффициент от 6 до 24) токсического действия.

Павших животных вскрывают и выявляют патологоанатомические изменения острой интоксикации препаратом. Проводят полное вскрытие, результаты фиксируются в протоколе. При необходимости проводят гистологические исследования с использованием гистохимики и электронной микроскопии.

На основании полученных данных исследуемый препарат классифицируется по токсичности (табл.16).

Таблица 16

Классификация химических веществ при однократном пути введения

(по Л.И. Медведеву, 1964).

Если препарат переносится животными без видимых последствий в дозе 20000 мг/кг и выше, количественная оценка его на токсичность не проводится, и он классифицируется как малотоксичный.

Дальнейшее исследование проводят по показаниям.