ГИБ РИДОМ НАЯ ТЕХНОЛОГИЯ - МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА

Прогресс в области инфекционной патологии в настоящее время в значительной мере связан с разработкой и внедрением в практику гибридомной технологии. Гибридные клетки, продуцирующие АТ к известным АГ, были описаны сравнительно недавно. Так, в 1969 г. Бщкхмсз сообщил о спонтанном образовании гибридных клеток между лимфоцитами и плазматическими клетками лейкозных мышей. При этом отмечено, что гибридные клетки неограниченно делились и продуцировали АТ к АГ вируса лейкоза. В работах Мо1гк показано, что в гибридных клетках миеломы и лимф о мы мышей продуцирууются иммуноглобулины. Однако гибридомы как продуценты монАТ заданной специфичности были впервые описаны КоЫег с соавт. Только в 1975 г. Авторы применили известный метод гибридизации соматических клеток к иммуноцитам: они осуществили слияние. Предложенная КоЫег с соавт. гибридлмная технология позволяет получать биохимически гомогенные, специфичные (направленные только одной антигенной детерминанты), стабильные по аффинности иммунные реагенты. Подавляющее большинство молекул монАТ, продуцируемых одним гибридомным клоном, идентичны друг другу. Использование монАТ при изучении вирусных и бактериальных патогенов открыло новые возможности в исследовании структуры, функции и синтеза АГ. Поэтому во многих странах мира, в том числе и нашей, ведутся работы по получению гибридом к АГ самых различных микроорганизмов. В настоящее время монАТ широко применяют в медицине и ветеринарии при изучении АГ структуры вирусов, иммуногенеза и патогенеза при вирусных инфекциях, а также усовершенствовании диагностики заболеваний и технологии изготовления вакцины.

Во всероссийском НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии получено более 500 клонов гибридом, секретирующих монАТ к возбудителям таких заболеваний, как африканская чума свиней, чума КРС, орто- и парамиксовирусные инфекции птиц, болезни Ибараки, эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей, катаральная лихорадка овец, вирусная геморрагическая болезнь кроликов, лейкоз КРС, а также к иммуноглобулинам различных видов животных.

Однако использование монАТ к нуклеопротеину - консервативному белку вируса гриппа А птиц (ВГП) не позволяет выявить АГ различия между шт. 13 различных подтипов ВГП, а также первого и второго серотипов па- рамиксовирусов птиц (ПМВ-1, ПМВ-2). Поэтому монАТ к нуклеопротеину этих вирусов было предложено использовать для диагностики орто- и пара- миксовирусных инфекций птиц. С этой целью был разработан двойной «сэндвич» - вариант твердофазного ИФА (ДАС-ИФА), позволяющий выявлять АГ ПМВ-1 и ПМВ-2.

С целью усовершенствования диагностики гриппа птиц предложена РНГА, для постановки которой используют эритроциты КРС, сенсибилизированные монАТ к нуклеопротеину ВГП. Реакция технически проста и на ее проведение требуется в 2-3 раза меньше времени по сравнению с ИФА. В то же время ДАС-ИФА и РНГА на основе монАТ к ВГП в отличие от других серологических методов позволяют обнаруживать АГ непосредственно в пробах органов животных без дальнейшей его идентификации в РТГА с набором антисывороток к гемагглютининам ВГП, ПМВ-1 и ПМВ-2, а при отсутствии этого этапа выделения вирусов на КЭ сокращает сроки диагностических исследований.

Использование монАТ, обладающих строгой специфичностью (компле- ментарностъю к определенному участку белка), дает возможность изучать тонкие структурные изменения антигенных детерминант в процессе эволюции и проводить эпитопное картирование вирусных белков. Так, с помощью монАТ получена эпитопная характеристика полипептидов вируса африканской чумы свиней с молекулярной массой 72, 22, 18 и 14 кД. Методом конкурентного ИФА с использованием монАТ к нуклеопротеину ВГП установлено, что в молекуле нуклепротеина ВГП имеется, по крайней мере, три неперекрывающихся антигенных сайта. На основе использования этих монАТ продемонстрирована вариабельность антигенных детерминант нуклео- протеина вируса гриппа.

В связи со способностью монАТ идентифицировать тонкие АГ различия стало возможным дифференцировать штаммы внутри подтипа и следить за АГ дрейфом вирусов. Учитывая узконаправленный характер реагирования монАТ с поверхностными белками ВГП можно предположить, что серотипоспецифичный участок в молекуле ГА представлен не одним, а несколькими эпитопами. Присутствие в молекуле нейраминидазы консервативных эпитопов создает возможность применения монАТ при разработке быстрых и надежных методов типирования шт. ВГП по нейраминидазе.

Использование монАТ в серологических реакциях позволяет дифференцировать близкородственные вирусы и служит основой для создания высокочувствительных и специфичных методов диагностики ряда вирусных болезней. На основе наиболее активных монАТ разработаны диагностические тесты, позволяющие дифференцировать эпизоотическую геморрагическую болезнь оленей и болезнь Ибараки от катаральной лихорадки овец. Обнаружено, что монАТ к группоспецифической антигенной детерминанте вируса катаральной лихорадке овец способны идентифицировать агент независимо от серотиповой принадлежности. Кроме того, высокая чувствительность метода ИФА на основе использования монАТ сделала возможным идентификацию этого вируса непосредственно в крови больных животных, что сокращает сроки диагностики. Вируснейтрализующие монАТ гфедставляют интерес не только как специфические лечебные препараты, но и как мощный инструмент изучения механизмов вирусной нейтрализации. С помощью различных монАТ могут быть идентифицированы эпитопы, участвующие в вирусной нейтрализации in vitro u in vivo. Благодаря применению монАТ определена топография нейтрализуемых и не нейтрализуемых эпитопов вирионов.

Таким образом, каждому из уровней диагностических исследований соответствуют диагностические методы, их чувствительность, специфичность, стоимость, четкость и информативность, а также длительность анализа пробы (Мищенко В.А., ВНИИЗЖ, 1995, 1997). Усовершенствован метод определения АГ и АТ - ускоренный иммуноферментный метод (УИФМ) на модели антигенов вирусов 9 семейств и определении ВНА в сыворотке крови КРС, верблюдов, лосей, яков, овец, свиней и морских свинок.

Настало время дать анализ эволюции методов лабораторной диагностики ряда вирусных инфекций животных, особенно вирусно-бактериальных инфекций. Эта область - одна из важнейших для эпидемиологов и эпизо- отологов. В медицинской практике спектр обследования детей с тяжелой респираторной и нейропатологией выявил высокую частоту сочетанных ви- русно-вирусных и вирусно-бактериальных инфекций. При всех смешанных инфекциях первично доминирующим возбудителем оказался вирус гриппа, который не только утяжелял течение вторичной инфекции - респираторной, энтеровирусной, дифтерийной или менингокковой, но и приводил к активации ряда оппортунистических инфекций, таких как герпес, цитомегалия, токсоплазмоз, краснуха, микоплазма и хламидиоз. Прослежена закономерность увеличения частоты вирусно-вирусных ассоциаций при нейроинфекциях в противоположность тяжелой респираторной патологии, где вторичные наслоения связаны с возбудителями невирусной природы (Аксенов О.А. и др. Тр. С-П инст. пед, 1996, :30).

Наконец, несколько слов о полезных функциях человеческих вирусов. Минуло 13 лет с тех пор, как были установлены неожиданные аспекты использования их в качестве биотехнологических инструментов. Использование выгод, предоставляемых в результате применения пяти ниже описанных вирусов открыло возможности изучения этиологии, патогенеза и поиска средств лечения заболеваний, в том числе и невирусной этиологии.

Во-первых, установлена возможность использования вируса БУ 40 в качестве модели для изучения трансформации клеток и процессов концероге- неза, продукции опухолевого антигена (Т-АГ), интеграции чужеродной ДНК в клеточный геном.

Во-вторых, описана роль аденовирусов в обнаружении и исследовании РНК, что в дальнейшем привело к углубленному пониманию закономерностей экспрессии фрагментарных генов клеток и вирусов и, в частности, позволило понять механизмы возникновения талассемии и некоторых иммунных заболеваний.

В-третьих, результаты изучения простого герпеса открыли возможность разработки методов переноса генетического материала метод трансформации вирусом герпеса клеток дефицитных по тимидинкиназе. Механизм «биохимической трансформации» в ТК-клетках открыл возможности переноса других эукариотических генов, в частности, макроинъекциоиного введения генетического материала в яйцеклетку мыши с последующим выведением потомства, содержащего вирусный ген тимидинкиназы.

В-четвертых, показана возможность использования процедур слияния клеток и получения гибридных клеточных популяций, что привело к созданию продуцентов монАТ.

Наконец, суммируя материал по вирусу Эппггейна-Барр как инструмента при получении перевиваемых лимф йодных клеток человека больных с генетическими нарушениями открывает пути исследования биохимии измененных клеток, возможности экспериментального манипулирования с генетическими материалами На этих примерах видно переплетение фундаментальных и прикладных аспектов в современной вирусологии.

Таким образом, оценка специфичности, чувствительности, технологичности, простоты применения диагностических методов с использованием МКА и поликлональных антисывороток свидетельствует о существенных преимуществах препаратов, созданных на основе монАТ, которые прочно входят в практику современной ветеринарии. Предполагается, что на рынке диагностических препаратов доля монАТ будет составлять 60%. Простота и высокая производительность гибридомной технологии позволили ей стать одной из ведущих отраслей биотехнологии. В настоящее время в мире существует более 500 фирм и объединений, производящих гибридомные АТ. При этом производится несколько сотен наборов монАТ диагностического назначения, которые, превосходя по своим свойствам и возможностям биопрепараты, существовавшие ранее, открывают новые направления практического и теоретического использования иммуноглобулинов.

Большие надежды возлагаются на монАТ как тонкого высокоспецифичного инструмента иммунологического распознавания. Они применяются для создания диагностических тест-систем. До сих пор монАТ получали, используя гибридомы из лимфоцитов мышей. В настоящее время успешно решается задача получения гибридом-продуцентов монАТ из лимфоцитов человека.

О новых источниках получения специфических иммуноглобулинов

Одним из удобных и доступных источников получения специфических иммуноглобулинов (IgY) являются желтки яиц иммунизированных кур, содержащие гораздо более высокие концентрации АТ по сравнению с сывороткой крови животных. Вместе с тем, изучение их биологических свойств, в частности, противовирусной активности, было проведено в основном в экспериментах in vitro. Показано, что иммуноглобулины, выделенные из желтков яиц кур, иммунизированных вирусом осповакцины, обладали ви- руснейтрализующей активностью при тестировании на ХАО 11-12 дн КЭ.