Тотипотентность ядер и их дифференцировка

В связи с уточнением знаний о механизмах митоза и развитием хромосомной теории наследственности стало очевидно, что идея А. Вейсмана о неравнонаследственных делениях ядер, во всяком случае в ее первоначальной трактовке, не соответствует действительности.

В ряде опытов Бриггса и Кинга были получены дефектные зародыши, в клетках которых не наблюдалось цитологически заметных хромосомных аберраций. 2.

Опыты по пересадке ядер из других тканей (не из кишечника головастика) и от головастиков еще более поздних стадий не привели к успеху. 3.

У отдельных видов (аскариды, некоторые насекомые), на ранних стадиях развития происходит закономерная потеря частей (диминуция) или целых хромосом (элиминация), которой избегают только клетки зародышевого пути, дающие начало половым клеткам. Обнаружены специ- альцые цитоплазматические структуры, содержащие РНК и ответственные за сохранение целостности хромосом в будущих половых клетках

ЭТИХ ВИДОВ. Однако И у ВИДОВ, ДЛЯ которых НИ диминуция, НИ DJIHMHim- іщя хромосом не описаны (дрозофилы, амфибии), детерминации клоток зародышевого пути также происходит на очень ранних стадиях рмшиггии и определяется факторами цитоплазмы, содержащими РНК.

Таким образом, хотя в ядрах дифференцированных клеток сохрцплот- •ся весь геном, его большая часть остается репрессированной; или правильнее сказать, что в ходе развития в полностью репрессированных ядрах (РНК не синтезируется) дерепрессируется часть генов, специфичных для данной ткани. Следовательно, ядра клеток разных ткапой отличаются друг от друга, что и дает основание считать их дифференцированными.

Об этом свидетельствуют и биохимические данные. Опыты по гибридизации ДНК на ДНК и РНК на ДНК показали, что в то время как ДНК разных тканей совершенно тождественны друг другу, синтезирующаяся в них РНК в той или иной степени качественно различна. Однако сам факт .дифференцировки ядер не требует таких строгих доказательств. Морфологические особенности ядер из разных тканей, различия в их размерах, форме, сродстве к красителям — все это достаточно хорошо иллюстрирует различия их функций. Некоторые примеры в этом отношении особенно показательны. Одним из таких примеров могут служить уже упоминавшиеся ламповые щетки ооцита.

Другим, еще более изученным примером ядерной дифференцировки являются гигантские политенные хромосомы слюнных желез личинок двукрылых насекомых. Их дифференцировка выражается в образовании характерных вздутий — пуффов, в которых происходит усиленный синтез иРНК. Локализация и порядок появления этих пуффов закономерно изменяются в ходе личиночного развития и зависят от тех же факторов, которые определяют развитие — в частности, гормонов липыш и окукливания. На примере этих пуффов удается наблюдать почти непосредственное влияние гормона окукливания — экдизона — на активность генов.

Доказательством дифференциальной активности генов в зависимости как от времени развития, так и от их локализации в зародыше служат многочисленные наблюдения над проявлением различных мутаций. Одни из них обнаруживаются уже на очень ранних стадиях, другие только во взрослом организме; одни затрагивают целые группы тканей, другие только единственный тип клеток. Таким образом, уже с самого начала функционирования ядер проявляется их дифференцировка, усиливающаяся в ходе развития.

Условно можно различать три группы генов. Первую составляют гены, функционирующие во всех клетках организма. Сюда относятся гены, ответственные за образование ферментов энергетического обмена, синтез макромолекул, образование общих для всех клеток структур и т. д. Ко

Хромосомный набор клеток слюнных желез хирономуса CMronomus tentants (по Биерману и

Клеверу, 1964 j

второй относятся гены, функционирующие в клетках ткани одного типа, например, те, которые определяют синтез миозина во всех мышечных тканях, коллагена во всех опорных тканях и т. д. В третью группу входят гены, специфичные для данного типа клеток. В ряде случаев это само собою очевидно. Так, синтез гемоглобина происходит только в эрит- робластах и только в них активны соответствующие гены. Также специфичен синтез многих гормонов, трипсина, амилазы и т. д. Однако и внешне одинаковые клетки должны различаться по активности некоторых генов, если клетки эти находятся в разных органах. Например, форма хрящей позвонка отличается от формы хрящевого скелета пальцев потому, что в них активны гены, специфические для этих органов. Это убедительно доказывается, в частности, мутациями, изменяющими число пальцев. Следовательно, в образовании каждого хряща, каждой мышцы должны участвовать свои особые гены, определяющие форму только этого органа и функционирующие только в нем.

Факторы дифференцировки

Проблема факторов, определяющих направление дифференцировки клеток, поставлена давно. Ее решение было основной задачей механики развития (см. главу 14). Тем не менее успехи в этой области еще не очень велики: выяснены факторы, определяющие лишь несколько десятков направлений из сотен дифференцировок, составляющих весь процесс развития. Еще меньше данных о химической природе этих факторов. Известные сегодня факторы дифференцировки можно разделить на несколько типов. Первым из них, действующим уже на самых ранних стадиях, следует назвать ооплазматическую сегрегацию.

Неоднородность цитоплазмы яйца у большинства видов обнаруживается еще в оогенезе и внешне выражается в неравномерном распределении желтка, пигмента, положении ядра и др. Эти различия создают одну ани- мально-вегетативную ось, обычно соответствующую передне-задней оси будущего зародыша. Однако у некоторых животных, например, асцидий, деоплодотворенное яйцо совершенно изотропно, т. е. не имеет никаких видимых отличий, позволяющих определить полюса и оси. Если такоо II it- по разрезать пополам в любой плоскости, то из каждой половины поели ом оплодотворения разовьется по одному целому зародышу (один нормальный диплоидный из той половины, где окажется женское ядро, другой — гаплоидный). Основные процессы, определяющие разделение цитоплазмы яйца на зоны — ооплазматическуго сегрегацию, происходит после оплодотворения перед первым делением дробления. У амфибий это выражается в появлении серого серпа — будущей мезодермальной области — ив обособлении эктодермальной зоны над серпом и энтодермальной под ним. У асцидий образуется несколько таких зон (5—6), у червей и моллюсков создается довольно сложная картина, образованная полярными плазмами и другими участками яйца, имеющими свои особенности. В ходе делений дробления клеточные стенки обособляют ооплазматические зоны друг от друга, как бы фиксируя их сегрегацию, а ядра клеток оказываются окруженными цитоплазмой, несколько отличающейся в разных частях бластулы'. Предполагается, что именно эти отличия определяют различия дифференциальной активности генов в этих частях и тем самым направление дифференцировки.

Механизмы ооплазматической сегрегации почти неизвестны. Расположение некоторых ее элементов, например, распределение желтка, вначале определяется положением ооцита в яичнике, а затем удерживается силой •тяжести, так как желточные гранулы тяжелее других компонентов яйца. Появление серого серпа после опытов А. Кертиса, пересадившего тонкий поверхностный слой яйца, связывают со структурой поверхности. Многочисленные опыты по центрифугированию яиц также показали, что искусственные перемещения компонентов цитоплазмы обычно обратимы и что наиболее жесткой структурой в яйце является его поверхностный слой — кортекс. Вместе с тем сами различия между зонами яйца, по-видимому, невелики; они могут легко смещаться, восстанавливая каким-то образом искусственно нарушенные количественные соотношения между ними. Так, если из яйца или бластулы лягушки удалить часть эктодермальной зоны, зародыш развивается вполне пропорциональным, хотя и соответственно меньшего размера. Еще более это заметно при разделении бластомеров: из каждого бластомера, если он содержит все три зоны (экто- мезо- и энтодермальную), хотя бы и в нарушенных пропорциях, также образуется нормальный зародыш.

В пределах каждой из зон можно обнаружить некоторые количественные различия, также влияющие на судьбу клеток, получивших эту цитоплазму. Так, в зоне серого серпа можно выделить центральный участок, с которого начинается гаструляция и который дифференцируется в хорду и оказывает индуцирующее влияние на эктодерму. По сторонам от этой зоны располагаются участки серого, серпа с несколько иными свойствами, которые впоследствии определяют дифференцировку мезодермальных производных.

Допускают, что в яйце морского ежа существует два противоположно направленных градиента — постепенные изменения свойств, идущие от анимального полюса к вегетативному и обратно. И хотя в нем вообще трудно различить обособленные зоны, а о природе ооплазматических различий почти ничего не известно, можно полагать, что последние состоят в различиях концентрации веществ, связанных со структурами цитоплазмы яйца, что и определяет их локализацию. Если действительно будет доказано, что различий в концентрации достаточно, чтобы направить диффе- ренцировку по иному пути, это будет означать, что такие факторы морфогенеза малоспецифичны.

Вторым фактором дифференцировки является индукция — химическое влияние одного зачатка на другой. Примеров индукции сейчас известно довольно много, но ни в одном из случаев точная природа индуцирующего вещества не была установлена. Дольше и тщательнее других изучался механизм первичной индукции — образования нервной ткани воздействием зачатка хордо-мезодермы на эктодерму, причем установлено,, что в этом случае индуцирующее влияние может быть осуществлено при ПОМОЩИ веществ, ВОЗМОЖНО, И близких ПО своей химической природе, НО’ полученных из источников, весьма далеких от естественного индуктора- (см. главу 14).

Недавно Г. Тидеман (1967) выделил из ткани цыпленка белок с молекулярным весом 25 ООО, обладающий индуцирующим действием на эктодерму лягушки. Весьма вероятно, что действующим началом других индукторов также являются белковые вещества той или иной природы.. Можно полагать, что при индукции нервной системы активным оказывается целый класс веществ, имеющих, очевидно, что-то общее- с тем естественным индуктором, который синтезируется в клетках зачатка хордо-мезодермы лягушки и действует на ее эктодерму. Биохимические- исследования, проведенные различными исследователями за последние десять лет, позволили сделать вывод, что индукционные вещества могут обладать различной природой, а их специфичность не может быть особенно' высокой. Раскрытие природы этих веществ и их роли в индукционных процессах — дело ближайшего будущего.

Другие факторы дифференцировки изучены значительно хуже, но и » этих случаях очевидна их невысокая специфичность. Так, по данным Г. В. Лопашева (1963), дифференцировка клеток зачатка глаза на сетчатку и пигментный эпителий может, по-видимому, определяться различными. условиями обмена: распластанные клетки, обладающие возможностью свободного обмена со средой, дифференцируются в пигментный эпителий, клетки же, находящиеся внутри зачатка,— в сетчатку. Аналогичным образом на дифференцировку оказывают влияние также такие факторы, как концентрация клеток, наличие волокон коллагена и др.

Гормоны формально нельзя отнести к факторам дифференцировки. Равномерно распределяясь по организму, они сами по себе не могут увеличить дифференцированность, т. е. определить разные направления развития у одинаковых клеток. Выяснилось, однако, что гормоны оказывают свое влияние не на все ткани, а лишь на способные на них реагировать (так называемые органы-мишени), причем в одном организме могут оказаться ткани, по-разному отвечающие на действие одного гормона. Характер действия гормонов в принципе не отличается от действия других морфогенетических агентов: они также являются причиной перехода клеток к новым этапам развития посредством включения новых генов.

Природа гормонов, как правило, хорошо известна, и механизмы их действия могли бы служить хорошей моделью для изучения механизмов дифференцировки вообще. Однако даже в отношении гормонов нельзя, по-видимому, говорить о едином механизме, ибо сама природа этих веществ крайне разнообразна (от сложных белков до тироксина, имеющего достаточно простое строение). Изучение точек приложения действия гормонов также дало различные результаты. Для одних (белковых) в ряде случаев показано действие на поверхность клетки, для других (стероиды) — на клеточное ядро. Многие из них прямо или косвенно изменяют функции.

?ллетки через хромосомный аппарат: их действие обычно сопровождается измопшшом характера синтеза иРНК.

Если непосредственное влияние факторов дифференцировки на ядра удалось обнаружить не во всех случаях, то зависимость ядра от цитоплазмы устаиоилопа •сейчас достаточно хорошо. Это особенно четко показано в опытах Дж. Гердона (1968) ' -по трансплантации ядер в ооцит или зрелое яйцо Xenopus laevis.

Из этих опытов следует, что синтез ДНК и начало или прекращение синтеза »РНК однозначно определяется цитоплазмой.

Механизмы дифференциальной активности генов

Таким образом, общая схема реализации наследственной информации кажется в принципе понятной; факторы дифференцировки вызывают дифференциальную активность генов, обусловливающую синтез специфических белков, которые и определяют свойства дифференцирующихся клеток. Одной из самых актуальных проблем оказывается проблема специфического включения генов.

Количество генов в геноме многоклеточных организмов велико, оно достигает порядка десятков и сотен тысяч (если судить по количеству ДНК, то число генов у высших организмов составляет несколько миллионов). В связи с этим выбор одного гена из ста тысяч других — уже достаточно сложная проблема.

Прежде всего каждый ген (или группа совместно включенных ге- ;нов — оперон) должен иметь «индекс», по которому он опознается. Для ДНК единственным способом записи информации является порядок нуклеотидов, число которых в таких индексах должно быть не менее десяти. Для того чтобы отличить один индекс от другого, само вещество, которое отыскивает и включает тот или иной ген, должно быть достаточно сложным и нести соответствующее количество информации. По-видимому, это должен быть один класс веществ, способных отличать одну нуклеотидную последовательность от другой. Такими свойствами обладают только сложные белки. Поэтому весьма маловероятно, чтобы разнообразные и обычно не очень специфичные факторы дифференцировки действовали эна гены непосредственно. Введение белка-посредника само по себе также «еще не решает проблемы, так как количество информации, которое получает клетка от действия малоспецифичного фактора, недостаточно для того, чтобы включить нужные гены.

Основная заслуга в разработке схемы регуляции работы генов принадлежит французским микробиологам Ф. Жакобу и Ж. Моно 1 (см. главы 23 и 24). И хотя она выведена для бактерий, а у многоклеточных пока не описана, ее основные принципы, видимо, общи всему живому, подобно записи наследственной информации в ДНК.

В ходе развития идет прогрессивная дифференцировка, т. е. каждый более общий зачаток под локальным действием факторов дифференцировки делится на более частные зачатки. Каждая дифференцированная клет- ла проходит, таким образом, ряд последовательных этапов, входя в состав все более мелких зачатков и все более специализируясь.

Способность данной ткани к дифференцировке обозначается термином компетенция. Обычно клетки обладают множественной компетенцией, вы- -бор которой определяется действием того или иного фактора дифферен- *

За разработку схемы дифференциальной активности генов Ф. Жакоб и Ж. Моно были удостоены в 1965 г. Нобелевской премии.

цировки. Один и тот же фактор, например, гормон, в тканях, обладающих разной компетенцией, вызывает совершенно разные дифференцировки. Состояние множественной компетенции, в соответствии со схемой Жакоба и Моно, можно представить как активность нескольких генов-регуляторов и наличие нескольких белков-дерепрессоров. В зависимости от того, какой эффектор действует на данную клетку, она включает ту или иную группу генов, определяющих следующий этап дифференцировки. Переход к новому этапу дифференцировки означает и появление новых компетенций, а это предполагает включение наряду со структурными генами и новых генов-регуляторов (старые при этом, очевидно, выключаются) .

Согласно схеме Жакоба и Моно, факторы дифференцировки в целом малоспецифичны, но они могут включить строго специфичные гены, если действуют в качестве эффектора на клетку, компетентную к этой диф- ференцировке. Действие одного из факторов означает реализацию одной из ранее предопределенных возможностей развития. Дифференцированная клетка является, таким образом, продуктом ряда последовательных действий различных факторов дифференцировки, постепенно приводящих ее к достигнутому состоянию.

Такова в самом общем виде во многом пока гипотетическая схема развития с ее регуляцией на молекулярном уровне. Для окончательного выяснения механизма дифференциальной активности генов потребуются конкретные исследования как каждого из элементов схемы, так и ее общего соответствия действительности.