Генетический контроль синтеза белков

Важнейшим достижением молекулярной генетики было выяснение цепи реакций, обеспечивающих передачу информации от ДНК к белку. Цитохимически было доказано, что ДНК локализована главным образом в ядре клеток.

Еще в 30-х годах XX в. было установлено, что в клетках наряду с ДНК содержится второй класс нуклеиновых кислот — рибонуклеиновые кислоты (РНК). В отличие от ДНК в РНК вместо сахара дезоксири- бозы содержится также пятичленный углевод — рибоза, а одно из пиримидиновых оснований — тимин — заменено на урацил. Кроме того, было показано, что РНК, как правило, не двуспиральна, а однонитчата.

Уже в опытах Браше (1942) и Кедровского (1951), а затем в обширных экспериментах ряда лабораторий (Т. Касперсон, А. Мирский, В. Ол- фри, П. Замечник и др.)' было показано, что интенсивный синтез белка происходит в тех участках клетки, где сосредоточено много РНК. Методы цитохимического анализа и электронной микроскопии позволили в начале 00-х годов четко подтвердить этот вывод. Само собой напрашивалось предположение, что именно РНК, близкая по своему составу к ДНК, переносит информаций) с ДНК на белок (см. также главу 23). Это предположение, высказывавшееся в устной и печатной форме многими учеными (Ф. Крик, С. Шпигельман, А. Н. Белозерский и А. С. Спирин и др.), было воплощено в четкую гипотезу лишь в 1961 г. Ф. Жакобом и Ж. Моно. Они предсказали свойства такой РНК (высокий молекулярный вес, сравнимый с весом участка ДНК, содержащего один ген; комлементарность к генам; быстрый синтез и высокая метаболическая активность), назвав ее «информационной РНК». После работ Жакоба и Моно в кратчайший срок (в том же 1961 г.) в ряде американских и японских лабораторий было доказано существование информационной РНК, или сокращенно иРНК (Ф. Гро, С. Шпигельман и многие другие). Р. Б. Хесин-Лурье и М. Ф. Шемякин (1962) в СССР впервые показали, что при размножении фага Т2 в бактериальной клетке синтезируются различные по вре'мени иРНК (так называемые «ранние» ? и «поздние»), В 1964—1965 гг. Г. П. Георгиев и одновременно с ним А. С. Спирин развили представление о том, что в клетках высших организмов существуют особые формы «запасания» считанной с ДНК генетической информации в форме так назывемых «информоферов», или «информосом». В '1965 г. Спирин и Георгиев экспериментально доказали существование этих структур в клетках.

Несколько ранее открытия и изучения свойств иРНК было обнаружено существование в клетках другого типа РНК, получивших название «транспортные РНК» [М. Хогланд, Д. Стефенсон и другие (лаборатория П. Замечника, США); Огата, Нахара и Морито (Япония), 1957]. Основное затруднение в понимании механизма передачи генетической информации от ДНК к белку заключалось в том, что прямой синтез белка на РНК был невозможен из-за чисто стерических несоответствий: молекулы аминокислот по своей величине не совпадают с размерами кодонов и надо было искать какой-то иной способ передачи команд от ДНК относительно порядка выстраивания аминокислот в строящейся молекуле белка. Ф. Крик (1954) предложил так называемую адапторную гипотезу, согласно которой функцию перевода языка нуклеиновых кислот на язык белков должны выполнять особые молекулы нуклеиновых кислот — адапторные РНК. Это предположение блестяще подтвердилось. Было выделено более 20 типов низкомолекулярных РНК, которые сначала были названы растворимыми, а затем переименованы в транспортные РНК (тРНК).

Выяснилось, что молекулы тРНК содержат два активных центра. Иа одном конце тРНК имеется одинаковая для всех изученных сортов тРНК последовательность нуклеотидов, к цепи которых прикрепляется молекула аминокислоты. Прикрепление осуществляется при помощи особых активирующих ферментов, число которых также близко к 20 (по числу типов аминокислот). В результате образуется комплекс аминоацил- тРНК. Второй активный центр в аминоацил-тРНК остается свободным, В этом центре содержится так называемый антикодон, т. е. последовательность оснований, комплементарная к кодону в иРНК. Таким образом, спаривание антикодона аминоацилированной тРНК с кодоном иРНК приведет к тому, что напротив данного кодона поместится соответствующая аминокислота.

Точное строение кодонов

Гамов рассчитал, что если каждая аминокислота кодируется тройкой нуклеотидов, то из четырех сортов нуклеотидов можно составить 64 сочетания. Долгое время казалось, что этот расчет не более чем гипотеза, которую в обозримом будущем вряд ли удастся доказать экспериментально. Но успехи молекулярной генетики оказались настолько значительными, что в короткий срок удалось не только определить состав кодонов, но и выяснить точное расположение оснований в пределах всех 64 кодонов.

Для изучения состава кодонов весьма плодотворным оказался метод, предложенный М. Ниренбергом и Дж. Маттеи (1961), заключавшийся во введении искусственно синтезированных РНК в систему для бесклеточного синтеза белка. Так как использовались искусственно синтезированные РНК известного состава, то, определив, какие аминокислоты преимущественно включаются в белок при тех или иных сочетаниях оснований, можно было получить информацию о том, кодоны какого суммарного состава кодируют различные аминокислоты. Такая работа была проведена в основном в лабораториях М. Ниренберга (Нобелевская премия, 1968) и С. Очоа (Нобелевская премия, 1959).

Но оставался открытым главный вопрос — каков точный порядок оснований во всех 64 кодонах. Метод его решения был разработан М. Ниренбергом и Ф. Ледером (1961). Эти исследователи искусственно синтезировали короткие отрезки РНК, содержавшие всего несколько нуклеотидов. При этом удавалось получать молекулы не среднестатистического состава, а совершенно точного строения. Это достигалось подсаживанием к синтезируемой искусственно молекуле олигонуклеотида (соединенных в цепь нескольких нуклеотидов) по одному точно известному нуклеотиду. Затем они определили, какой минимальной длины олигонуклеотид может быть использован для того, чтобы присоединить к себе хотя бы одну молекулу тРНК, несущую аминокислоту. Оказалось, что тринуклеотид, т. е. олигонуклеотид, равный по длине кодону, сорбирует на себе аминоацил- тРНК. Кроме того, было выяснено, что такое соединение строго специфично: каждый кодон присоединяет к себе только соответствующую тРНК и, скажем, присоединение тРНК, несущей триптофан, происходит только к тринуклеотиду УГГ (напомним, что в РНК в отличие от ДНК вместо пиримидинового основания — тимина имеется урацил) и никакие другие типы тРНК к этому кодону не присоединяются. Приготовив всевозможные кодоны, авторы изучили присоединение к ним различных тРНК, несущих разные аминокислоты. Аминокислоты метились радиоактивными изотопами, и по этой метке судили о присоединении амино- ацил-тРНК. В результате этих и последующих работ ряда авторов (Г. Корана, Г. Виттман, Ч. Яновский и др.) к 1966 г. удалось получить данные

о полном строении генетического кода.

Использование синтетических полинуклеотидных матриц в бесклеточ- ных белоксинтезирующих системах позволило в течение пяти лет после- Первый

нуклеотид

кодона Второй нуклеотид кодона Третий

нуклеотиД

кодона У Ц А г У фен сер тир цис У фен сер тир цис ц лей сер охра опал А лей сер амбер трип Г ц лей про гис арг У лей про гис арг Ц лей про глн арг А лей про глн арг Г А • илей тре асн сер У илей тре асн сер Ц илей тре ЛИЗ арг А мет тре лиз арг Г Г вал ала асп гли У вал ала асп гли Ц вал ала' глу гли А вал ала глу гли Г Примечание. Фен означает фенилаланин; лей — лейцин; илей — изолейцин; мет — метионин; вал — валин; сер — оерин; про — пролин; тре — треонин; ала — аланин; тир -- тирозин; гио — гис- тидин; глн — глутамин; асн — аспарагин; асп — аспарагиновая кислота; лиз — лизин; глу — глутаминовая кислота; цис — цистеин; трип — триптофан; арг — аргинин; гли —глицин; охра; амбер и опал — бессмысленные кодоны,

открытия Ниренберга и Маттеи расшифровать природу практически всех кодонов.

Не последнюю роль в деле расшифровки генетического кода сыграли также работы немецкого биохимика Г. Г. Виттмана, который в течение 1961—1965 гг. изучал аминокислотные превращения в белке ВТМ, вызванные химической модификацией вирусной РНК. В 1965—1967 гг.

С. Бреннер, Дж. Беквит и другие уточнили смысл некоторых кодонов, которые служат для прекращения синтеза белковой цепи (они получили название терминирующих кодонов: амбер, охра и опал).

Следует упомянуть об установлении двух моментов, связанных с генетическим кодом. Первое — вырожденность кода, означающая, что одна аминокислота может кодироваться несколькими кодонами. Из таблицы кода видно, что одной и той же аминокислоте нередко соответствует несколько кодонов. Это немаловажное обстоятельство позволяет иметь разным организмам несколько различающиеся «диалекты». Действительно, перекодировка сообщений, записанных языком нуклеотидов в ДНК в язык аминокислотных последовательностей в белках, происходит в рибосомах с участием РНК. Отсутствие тРНК, узнающей некоторые из кодонов одной и той же аминокислоты, приведет к тому, что эти кодоны не будут узнаны и останутся бессмысленными в этой клетке. Экспериментальное доказательство правильности такой трактовки вырожденности генетического кода было дано в работе Ф. Чэпевилла с соавторами (1961). По-видимому, этот механизм действует при размножении ряда вирусов, актинію риам лишающихся и одних видах организмов и не способных к размножению в других.

Второй интересный момент—универсальность генетического кода. Приведенные выше данные получены в основном на клетках Е. coli и па фагах. Проверка правильности кодонов in vivo была проведена на фагах и ряде вирусов. О справедливости данных, приведенных в таблице, свидетельствовали также отдельные опыты с высшими организмами. Поэтому признается, что генетический код в природе универсален. Насколько справедливо такое заключение и нет ли из пего исключений, покажет будущее.

Молекулярные механизмы рекомбинации

С момента открытия Т. Г. Морганом в 20-х годах процесса обмена участками хромосом (кроссинговера) исследователи не раз пытались представить механизм, объясняющий последовательность протекающих при рекомбинации реакций. Все гипотезы, высказанные и в рамках классической и в современной молекулярной генетике, можно разделить на два класса: обменные и контактные гипотезы. Согласно представлениям одних исследователей, хромосомы сначала претерпевали разрыв нитей, а затем происходило замыкание концов одной нити с концами нити от другой хромосомы; согласно другим гипотезам, процесс начинался с пространственного примыкания хромосом в каких-то участках, после чего в этих точках происходили разрыв нитей и «неправильное» их соединение. Поскольку в настоящее время установлено, что стабильность хромосом высших организмов в большой степени зависит от непрерывности молекул ДНК, входящих в хромосомы, стало возможным, по аналогии с тем, как это делалось в микробной генетике, перенести вопрос о молекулярных основах процесса рекомбинации в сферу изучения поведения молекул ДНК, не затрагивая вопроса о поведении молекул хромосомных белков, окружающих ДНК (Г.

В настоящее время окончательной схемы, объясняющей механизм рекомбинации, не существует. Для иллюстрации направления поисков такого механизма можно привести две схемы — Г. Вайтхауза и П. Говард-Фландерса, получившие наибольшее признание.

В механизме, предложенном Вайтхаузом (1963—1965), рекомбинация начинается с возникновения однонитевых разрывов в молекулах ДНК (этап 2). Затем однонитевые участки ДНК отходят от неповрежденных нитей ДНК (этап 3), создавая условия для начала рекомбинационного синтеза ДНК. Этот синтез происходит по матрице неразрезанной однони- тевой ДНК (этап 4). Поскольку синтезированные участки комплементарны к противоположным им участкам, ранее отошедшим по местам разрывов, то, естественно, что между ними может произойти спаривание, в результате чего образуются участки гибридных молекул (этап 5): вновь синтезированный участок одной хромосомы соединится со старым участком другой хромосомы, ранее отошедшим от нее, а участок, вновь синтезированный на второй хромосоме, соединится со старым участком первой хромосомы. Тем самым будет положено начало образованию рекомбинантных молекул, но сами хромосомы еще будут соединены перекрестно. Чтобы отсоединить их, нужно разрезать оставшиеся пока неповрежденными старые нити обеих молекул (этап 6). Воссоединение участков в новом порядке завершит образование рекомбинантных молекул.

По сути дела, тот же механизм учитывается в схеме П. Гоїшрди Фландерса (1965, 1966). Эта схема также весьма сходна со схемой тим новой репарации. Как и в случае последней, при рекомбинации долги им сначала осуществиться разрывы сахаро-фосфатного остова молокул (этап 1), затем разрушение однонитевых участков (этап 2). Следую щим, третьим этапом рекомбинации должно быть комплементарпоо сим ? ривание молекул на ограниченном участке (зона синапса). Затем и образовавшейся молекуле (гетеродуплексе), соединяющей фрагменты обоих рекомбинирующих молекул, должна произойти застройка однопитопмх участков (этап 4) и, наконец, их воссоединение (этап 5).

До СИХ пор не ЯСНО, ЧТО является причиной возникновения ОДЫОШ1- тевых разрывов в двунитевых молекулах ДНК. По нашему мнению, начало такому разрыву могут положить нарушения или изменения оснований в структуре ДНК, возникающие либо под действием кваптоп лучистой энергии, либо различных химических агентов как внутриклеточной, так и внешней по отношению к клетке природы. Эта точки зрения *, высказанная нами в 1969 г., получила в настоящее время экспериментальное подтверждение в опытах на микроорганизмах.

Важным и пока еще также не получившим должного разрешения является вопрос о том, как происходит объединение нитей друг с другом во время рекомбинации. В настоящее время в результате исследования Э. Баутца (1967—1971) в США и Ю. П. Винецкого (1970) в СССР установлено, что зона синапса захватывает не менее 500—1000 нуклеотидов.

Мутации и генетический код

В таблице кода указахш три кодона УАА, УАГ и УГА, которые не кодируют никаких аминокислот и потому называются нонсенс-кодонами, или терминирующими кодонами. Открытие этих кодонов было важным шагом в понимании механизма синтеза белка. Выше упоминалось о том, что иРНК может быть считана сразу с нескольких цистронов. Возник вопрос о том, каким образом при синтезе белков с такой полицистроп- ной иРНК происходит обрыв чтения на конце одного цистрона и начинается чтение следующего цистрона. Обнаружение нонсенс-кодонов дало ответ на первый вопрос. К тому же стало понятным поведение некоторых мутантов, выделенных до этого у вирусов и бактерий. Это касается прежде всего так называемых амбер-мутантов фагов, которые могли размножаться в клетках одних линий бактерий и оказывались не способными к этому в других. Анализ этих мутантов показал, что в тех пиг ниях бактерий, где развитие амбер-мутантов фагов не происходило, дефект был связан с неполным прочтением мутировавших генов. Под их контролем формировались не целые молекулы белка, а обрывки полипеп- тидной цепи одинаковой длины. Такие амбер-мутанты удалось выделить практически для всех генов фага Т4 (Р. Эпштейн, 1963; Р. Эдгар, Г. Денхардт и Р. Эпштейн, 1964; Р. Эдгар, 1965, и др.), а также для гена щелочной фосфатазы кишечной палочки (лаборатория А. Герена в США, 1962—1964), а сам метод изучения амбер-мутантов оказал большую услугу ученым, позволив описать неизвестные ранее гены. Весьма примечательным было и то, что свойства амбер-мутантов фагов прояв-

1 Подробнее об этом см.: Сойфер В. Н. Молекулярные механизмы мутагенеза. М., «Наука», 1969, стр. 417—421.

Последовательность реакций при матричном биосинтезе белков (по А. С. Спирину и Л. П. Гавриловой, 1963) лялись только при заражении такими фагами определенных видон (inn- терий. При заражении же других видов дефект исправлялся, и сиптони- ровались молекулы белка нормальной длины, хотя нередко и с илмошш ными свойствами.

Спустя некоторое время удалось выделить так нызываемые охри му танты (УАА-кодон) (С. Бреннер, А. Стреттон и С. Каплан, 1965; М. Ной герт и А. Герен, 1965) с точно такими же свойствами, а затем и му танты, у которых обрыв чтения иРНК происходил на кодоне УГА (омпл кодон), (С. Бреннер, JI. Барнет, Е. Кац и Ф. Крик, 19117), И охра-мутанты, и мутанты, несшие нонсенс-кодон УГА, удалось исири вить (супрессировать) в специальных линиях, имевших так называемый гены-супрессоры. Все гены-супрессоры ОТНОСИЛИСЬ к трем классам: пм> бер-супрессоры (su-1, su-2 и su-З), восстанавливавшие чтение иГІІК, оборванное на амбер-кодоне; охра-супрессоры (su-4 и su-5), подав ли и - шие амбер- и охра-кодоны; супрессоры кодона УГА.

Свойство супрессии оказалось связанным с наличием в клетках, несущих супрессорные гены, молекул тРНК, способных узнавать нонсенс- кодон (Г. Броуди и Ч. Яновский, 1963; Дж. Беквит, 1964; Ч. Яновский, 1966; Г. Корана и др., 1966). Такие' мутантные тРНК могут спариваться с нонсенс-кодоном и таким образом подставлять против них аминокислоту. Анализ подстановок, осуществляемых в супрессорных линиях, показал, что в su-1-линиях Е. coli тРНК подставляют против амбер-кодона серил; в su-2 — глутамин, в su-З — тирозин. В результате обрыва чтения но происходит и формируются полные молекулы белка. Чаще всего они имеют измененные свойства, так как на месте возникшей амбер-мутации подставляется не та аминокислота, которая была до возникновения амбер- кодона.

Анализ природы различных мутаций привел к выводу, что все точечные мутации можно разделить на три основных класса: 1.

Миссенс-мутации — мутации, при которых изменяется смысл кодона; в этом случае против него встает неверная аминокислота, и свойства синтезируемого белка меняются. К миссенс-мутациям относится большинство мутаций, описанных ранее. 2.

Нонсенс-мутации — мутации, при которых возникает нонсенс-кодон, не кодирующий никаких аминокислот, и на нем обрывается чтение I — свободные субъединицы рибосом, отдельные транспортные РНК и аминоацил- тРНК в клетках перед началом синтеза белка; II — присоединение индивидуальной молекулы иРНК к малой субъединице рибосомы; III — присоединение большой субъединицы рибосомы к малой субъединице, заряженной иРНК. Этот комплекс в нормальных условиях остается стабильным до конца считывания матрицы иРНК; IV — присоединение к малой субъединице рибосомы аминоацил-тРНК (первой всегда присоединяется формилметиониновая аминоацил-тРНК); V — конец аа-тРНК, несущий аминокислоту, присоединяется к большой субъединице рибосомы; VI — конец иРНК с присоединенной к нему формил- метионино?ой тРНК «вдвигается» в большую субъединицу рибосомы; VII — начало следующего цикла в работе рибосомы. Сно

ва к малой субъединице присоединяете)! аа-тРИК, соответствующая очередному кодону иРНК, вошедшему в рибосому; VIII — конец аа-тРНК, несущий аминокислоту, присоединяется к большой субъединице. Теперь две аминокилоты (формилметиоии- новая и очередная, вошедшая в рибосому) оказываются в пространственной близости; IX — формилметионин перебрасывается па очередную аминокислоту: начался синтса

полипептидной цепи; X — транспортная РНК, освободившаяся от аминокислоты фор- милметионина, покидает рибооому, уступая место для очередного акта «протягивания» иРНК в рибосому; XI — нить информационной РНК продвигается в рибосому еще ни один кодон; XII — начало третьего цикла работы рибосомы: в малую субъединицу

вошла новая аминоацил-тРНК иРНК и рибосомих. К таким нонсенс-кодонам относится кодон УАГ (ам- бер-кодон), кодон УАА (охра-кодон) и кодон УГА (опал-кодон). 3.

Мутации со сдвигом чтения (или, как их часто называют, мутации сдвига рамки). Эти мутации, изученные Криком и его сотрудниками, позволили доказать трехбуквенность генетического кода. Мутации сдвига чтения возникают после того, как одно или несколько оснований выпадут из молекулы ДНК или внедрятся в нее. Интересно отметить, что сдвиг чтения чаще всего приводит к тому, что в какой-то точке он заканчивается нонсенс-кодоном и на нем чтение обрывается вообще.

В последнее время был решен также вопрос, как начинается синтез белка. Мы уже начали описывать этот процесс с того момента, когда к пептидильному центру рибосомы была присоединена молекула строящегося белка и ее дальнейшее наращивание осуществлялось за счет переброса пептидной цепи на аминокислоту, присоединенную к аминоациль- ному центру. Но в самом начале цистрона, когда пептидильный центр еще не занят, переброска на аминокислоту произойти не может, и, даже если аминоацетил-тРНК войдет в аминоацильный центр и спарится с кодонами иРНК, сдвига рибосомы по молекуле иРНК не произойдет, ибо первый кодон так и останется пустым.

Эта загадка была решена после открытия особого типа тРНК — так называемой формилметиониновой тРНК. Оказалось, что тРНК метионина может присоединять в результате ферментативной реакции формильную группу к аминокислоте:

СНз

!

S

I

СНг

СНа

I сн / \

НС—NH СООН

Такая формилметиониновая тРНК может присоединиться к двум кодонам АУГ и ГУГ, если только они расположены в начале цепи иРНК. В' случае, когда эти кодоны располагаются в середине иРНК, АУГ кодирует метионин, а ГУГ — валин.

Только формилметиониновая тРИК может войти в пептидильный центр рибосомы в начале синтеза. После этого может произойти переброс формилметионина к аминокислоте, присоединенной к аминоацильному центру. В результате все цепи белка начинаются с одной и той же аминокислоты — формилметионина. После того как построенная цепь белка отсоединится от рибосомы, формильная или даже метиониновая группы могут быть ферментативно отщеплены от белка. Таким образом, установлено, что роль иницирующих кодонов играют АУГ и ГУГ, если они располагаются в начальном участке иРНК, а окончание синтеза происходит на нонсенс-кодонах.

Выяснение природы, строения и функционирования генетического кода явилось огромным достижением современной биологии. Последние успехи в искусственном синтезе белка, нуклеиновых кислот, особенно тех, которые обладают способностью к программированию живых вирус ных частиц (работы лаборатории А. Корнберга в Стэнфордском университете, США), позволяют надеяться, что одна из основных проблем современной биологии — искусственный синтез живого с нужными человеку свойствами — будет в конце концов разрешена.