Лабораторная работа №41. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛИЗОЦИМА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ГИДРОБИОНТОВ В ОТВЕТ НА ИЗМЕНЕНИЕ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ (Методика предложена И. А. Кондратьевой и А. А. Киташовой)

Лизоцим — вещество, относящееся к группе ферментов (мура- мидаза) и обладающее бактерицидным действием. Обнаруживается в различных тканях организма, особенно вовлеченных в воспалительный процесс. Лизоцим находится в больших количествах в яйцах птиц, в слюне, в нейтрофилах и макрофагах. При их повреждении лизоцим поступает в окружающие ткани и плазму крови из неповрежденных макрофагов и лейкоцитов. Угнетает реакции отторжения трансплантации у кроликов и мышей. Он является неспецифическим фактором естественной резистентности организма.
Метод определения концентрации лизоцима часто используют для регистрации происходящего в организме воспаления, стресса или ухудшения условий среды обитания, так как при этих явлениях наблюдается нарастание его концентрации в сыворотке крови позвоночных или гемолимфе и целомической жидкости беспозвоночных животных по сравнению с нормой.

Рис. 41.1. Концентрация лизоцима в перивисцеральной жидкости морских звезд в зависимости от условий содержания и от введения различных
антигенов

Принцип метода, лежащий в основе лабораторной работы, аналогичен предложенному в лабораторной работе № 40.
Для моделирования неблагоприятных условий окружающей среды гидробионтов (морских звезд, пресноводных моллюсков и др.) содержат в лабораторных аквариумах, где экспериментально ухудшают условия содержания с целью стимуляции у животных иммунозащитных реакций (см. лабораторную работу № 40).
У морских звезд (пресноводных моллюсков), содержавшихся в условиях, приближенных к естественным, при введении различных антигенов в перивисцеральной жидкости увеличивается содержание лизоцима (рис. 41.1, белые столбики). При ухудшении условий содержания концентрация лизоцима в перивисцеральной жидкости гидробионтов возрастает. Наибольшее влияние на них оказывает пониженная аэрация (черные столбики): у опытных животных количество лизоцима увеличивается независимо от природы вводимого антигена.
Оборудование, материал и реактивы:
гемолимфа; целомическая жидкость или сыворотка крови; ацетоновый бактериальный порошок Micrococcus lysodeicticus (см. Справочный материал к лабораторной работе); эфир; натрий- фосфатный буфер; лизоцим; жидкая питательная среда МПБ (см. Справочный материал к лабораторной работе № 8); физиологический раствор; дистиллированная вода; стеклянная лабораторная посуда; бумажный фильтр; фарфоровая ступка с пестиком; спектрофотометр или КФК; антигены (БСА, ЛПС, ЭЧ); профильтрованная через нитроцеллюлозный фильтр с порами диаметром

45 мкм морская вода; аквариумы; бензин; компрессор для аквариумов; термометр для воды; лабораторные животные — морские звезды.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Получить у преподавателя ацетоновый порошок Micrococcus lysodeicticus для построения калибровочной кривой. В 5-миллиметровую кювету внести 1,5 мл полученной взвеси, 0,5 мл физиологического раствора и 1 мл стандартного разведения лизоцима. Смесь быстро размешать и измерить оптическую плотность раствора при длине волны 540 нм через 15 и 180 с на спектрофотометре или КФК. Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности раствора от концентрации в нем лизоцима при стандартных разведениях. Смешать исследуемую гемолимфу, целомическую жидкость или сыворотку крови с бактериальным ацетоновым порошком в натрий-фосфатном буфере. Провести измерение оптической плотности и определить концентрацию лизоцима в исследуемом образце по калибровочной кривой, построенной по стандартным разведениям лизоцима. Морских звезд разделить на 4 группы и поместить в отдельные аквариумы. В аквариум, где содержатся животные группы 1, добавить в воду бензин в качестве загрязняющего агента (0,003 %); в аквариуме, где содержатся животные группы 2, повысить температуру воды до 15 °С; в аквариуме, где содержатся животные группы 3, уменьшить аэрирование воды; группа 4 — контроль. Для стимуляции иммунных реакций животным каждой группы ввести антигены (БСА, Л ПС, ЭЧ) или профильтрованную морскую (речную) воду. Через 24 ч отобрать пробы перивисцеральной жидкости и провести сравнительный анализ концентрации лизоцима у контрольных и экспериментальных животных. Концентрация лизоцима в перивисцеральной жидкости морских звезд увеличивается в ответ на ухудшение условий среды обитания.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ              4
5
Приготовление ацетонового порошка М. lysodeicticus              7
и построение калибровочной кривой              ‘
Бактериальную массу М. lysodeicticus, выросшую на жидкой питательной среде МПБ, дважды отмыть физиологическим ра

<< | >>

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа №41. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛИЗОЦИМА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ГИДРОБИОНТОВ В ОТВЕТ НА ИЗМЕНЕНИЕ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ (Методика предложена И. А. Кондратьевой и А. А. Киташовой):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -