Диагностические системы

Современные диагностические системы должны характеризоваться следующими качествами: более высокой чувствительностью и, главным образом, специфичностью, а также максимальной автоматизацией и, как следствие, стандартизацией большинства этапов анализа. Не менее важно добиваться уменьшения вероятности субъективной оценки результатов и снижения роли человеческого фактора, повышать производительность системы при низкой себестоимости выполнения анализа, сокращать общее количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа и компьютеризировать ввод и обработку результатов анализов совместимым программным обеспечением.
В современной отечественной практике в области сельскохозяйственного растениеводства, в основном, применяются диагностические системы, не отвечающие вышеизложенным требованиям и основанные на простых иммуноферментных методах анализа. В определенной степени это могло бы быть обусловлено тем, что развитие ПТ IP-методов анализа вирусных, грибных, бактериальных и нематодных поражений лимитируется отставанием по секвенированию их геномов. К примеру, из 222 бактериальных геномов, работа над секвенированием которых велась или была закончена к 2003 году, фитопатогенами были менее 14 (Lopez et al., 2003). С другой стороны, в реальном секторе практически полностью отсутствуют лаборатории, оснащенные современным оборудованием и квалифицированными кадрами. Исключение составляют лишь некоторые подразделения службы карантина растений.

Говоря о положении в диагностике вирусных фитопатогенов картофеля в сегодняшней России в целом, можно упомянуть лишь несколько разработок. Еще в начале 80-х годов прошлого века, в СССР были разработаны ИФА-тесты основных вирусных патогенов картофеля, которые до сих пор производятся на базе ВНИИКХ (Атабеков И. Г., Тальянский, 1997). Довольно качественные моноклональные антитела к ряду вирусов картофеля были получены в ИБХ РАН, однако эти работы не завершились созданием законченных тест-систем.
Современные методы диагностики вирусных патогенов картофеля, основанные на методе ПЦР, разработаны в конце прошлого и в начале нынешнего века во многих лабораториях мира, в том числе и в России. Здесь, в частности, хотелось бы отметить разработку системы универсальной ПЦР-диагностики вирусов растений, основанной на их групповой принадлежности (Маагоп, Zavriev, 2002). В настоящее время на нашем рынке наиболее широкий ассортимент диагностических наборов для определения фитопатогенов предлагает ООО «АгроДиагностика». Для диагностики вирусных патогенов картофеля этой фирмой освоено производство ПЦР тест-систем в формате электрофореза, FLASH- ПЦР и ПНР в реальном времени. В настоящее время освоен выпуск наборов для диагностики вируса скручивания листьев картофеля, М, S, X, Y и А вирусов картофеля, вируса метельчатости верхушек картофеля и вироида веретеновидности клубней картофеля. Пример того, как обрабатываются и выдаются результаты ПЦР-диагностики образцов картофеля на наличие в них патогена с помощью упомянутых наборов в формате FLASH и соответствующего программного обеспечения представлен на Рис. 4.
К сожалению, в России сегодня использование и внедрение этих разработок даже при тестировании посадочного материала широкого применения пока не нашло. Исключением являются частные компании, в первую очередь производители посадочного материала мини-клубней картофеля, например, фирма «Дока», Зеленоград. Как правило, они используют тест-системы западных компаний, в первую очередь фирмы «Agdia» (США) (см. www.agdia.com). Так, «Agdia» предлагает ELISA-тесты к 16 вирусным патогенам картофеля. Важно отметить, что часть наиболее экономически значимых тестов предлагается в варианте т. и. стрипов (Рис. XXXIX), где анализ хоть и довольно дорогой (около 10 долларов США за один тест), но настолько прост, что не требует специальной квалификации персонала, занимает около 20 минут и может производиться в полевых условиях. Среди европейских фирм на рынке анализа фитопатогенов следует отметить также фирмы «Adgen» (Великобритания), и «Agritest» (Италия), «Ingenasa», «Plant-Print Diagnostics» и «Durviz» (Испания), и «Лёве» (Германия), спектр услуг которых по некоторым патогенам дополняет продукцию «Agdia».
Следует упомянуть и весьма эффективные гибридизационные методы. С помощью этих методов можно не только диагностировать тот или иной патоген, но и получить при необходимости количественную информацию относительно копий анализируемого гена или фитопатогена. В России на основе гибридизационного метода в МГУ им. М. В. Ломоносова была разработана система идентификации вироида веретеновидности клубней картофеля (Атабеков И.Г., Тальянский, 1997). Важно отметить, что в системе использовался не радиоактивный, а флуоресцентный зонд, что делает этот метод безопасным. Похожие методы диагностики вироида веретеновидности клубней картофеля и других вирои- дов, основанные на радиоактивно-меченных и флуоресцентных зондах, используются в рутинных анализах и за рубежом.
При диагностике бактериальных инфекций основными остаются ИФА-методы. Необходимо отметить, что чувствительность ИФА-методов диагностики бактериальных фитопатогенов даже с использованием моноклональных антител не всегда достаточно высока, особенно в случае латентной инфекции.

Это обстоятельство требует предварительного увеличения количества бактерий в образце путем их специфической репродукции (Caruso et al, 2002). В каждом конкретном случае необходим подбор оптимальных условий репродукции (среды, температура, условия инкубации образцов и т.п.). Во многих случаях существует необходимость тестирования большого числа образцов малоквалифицированным персоналом, для чего предложены простые коммерческие методы, использующие процедуру иммуноферментного анализа отпечатков образцов растительных тканей на нитроцеллюлозной мембране (tissue print-ELISA). Специфичность этого метода достаточно высока, однако чувствительность, как правило, недостаточна для достоверной диагностики ряда бактериальных инфекций. Некоторые специфические задачи решаются с использованием метода проточной фотометрии (Alvarez, 2001). Бактериальные клетки при этом идентифицируются с помощью конъюгатов специфических антител с флуоресцентным красителем. Исследование растительных экстрактов этим методом поз-
воляет отделять неинфицированные образцы от инфицированных на ранних этапах развития бактериальной инфекции. Существенным ограничением использования данного метода в настоящее время является высокая стоимость применяемой аппаратуры.
На мировом рынке имеются коммерческие диагностические наборы на фитопатогены картофеля, основанные на методе ИФА. Например, фирма «Agdia» предлагает ELISA-тесты к трем патогенам картофеля бактериального происхождения.
При диагностировании бактериальных фитопатогенов методом ПЦР во многих случаях необходимости в их размножении нет. Когда она необходима, следует оптимизировать как этот процесс, так и условия ПЦР-амплификации (Penyalver et al, 2000). Чувствительность диагностики бактериальных фитопатогенов может быть увеличена также путем использования особого варианта ПНР - т. и. «кооперативной ПНР» (Olmos et al., 2002). Этот метод был успешно применен для обнаружения возбудителя бурой гнили картофеля - бактерии RaJslonia solanaceanim в образцах воды. В самое последнее время с целью обнаружения единичных бактериальных клеток в образцах растительных тканей используется метод гибридизации in situ с использованием флуоресцентных ДНК-зондов, узнающих видоспецифические участки бактериальных геномов (Volkhard et al., 2000). В России рынок диагностики бактериальных инфекций картофеля методом ПНР представлен наборами, предлагаемыми ООО «АгроДиагнос- тика» для возбудителей кольцевой гнили картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) и бурой бактериальной гнили картофеля {RaJslonia solanaceanim).
Немаловажными патогенами картофеля являются нематоды, которые поражают практически все виды растений, включая картофель. В связи с тем, что заболевания, вызванные нематодами приводят к очень большим потерям урожаев, мониторинг фитопатогенных нематод весьма важен и актуален. В Европе и в России цистообразующие нематоды, поражающие картофель - Globodera rostochiensis и Globodera pallida - имеют статус карантинных патогенов.
В настоящее время обнаружение и идентификация нематод осуществляется как с помощью классических, в первую очередь, морфологических, так и современных методов, основанных на ПНР технологиях (Ibrahim et al., 2001). Наиболее четко и точно видовую идентификацию нематод в современных лабораториях проводят с помощью ПНР (подробные методические описания
можно найти на сайте www.nematode.unl.Edu/nemaid). На российском рынке на обе вышеупомянутые нематоды имеются ПЦР- диагностические наборы фирмы ООО «АгроДиагностика».
Другой группой патогенов картофеля, наносящих этой культуре немалый вред, являются инфекции грибной природы. В последние годы наблюдается заметная тенденция и прогресс в использовании молекулярных методов диагностики не только отдельных фитопатогенных грибов, но и в микологии в целом (Atkins, Clark, 2004). Однако, по состоянию на сегодняшний день, диагностических систем для рутинной диагностики фитопатогенных грибов, в том числе и карантинных, с использованием ДНК технологий в России не производится. На рынке имеются основанные на ИФА тест-системы фирмы «Agdia» к двум грибным патогенам картофеля.
Таким образом, на сегодняшний день ситуацию по рынку диагностики фитопатогенов картофеля можно суммировать следующим образом. В мировой практике диагностика фитопатогенов широко применяются в сельскохозяйственном растениеводстве. При этом имеется целый ряд фирм, в том числе и в России, предлагающих коммерческие диагностические наборы, подавляющее большинство которых основано на различных модификациях метода ИФА, уступающих по своей чувствительности и специфичности методам, основанным на ПНР В России рынок ПЦР-диагностики фитопатогенов, в том числе и патогенов картофеля, только создается и пока представлен ООО «АгроДиагностика». С сожалением следует констатировать, что в России использование и широкое внедрение этих разработок в практику сельскохозяйственного производства пока не применяется даже при тестировании посадочного материала, разве что в отдельных частных компаниях, занимающихся производством посадочного материала картофеля.

Еще по теме Диагностические системы:

1. Глава 8 ПОНЯТИЯ О СИСТЕМЕ УДОБРЕНИЙ И ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ СИСТЕМЫ УДОБРЕНИЯ В СЕВООБОРОТЕ
2. ПРИМЕНЕНИЕ БЕСПОДСТИЛОЧНОГО НАВОЗА КАК СОСТАВНАЯ ЧАСТЬ СИСТЕМЫ УДОБРЕНИЯ Основы системы удобрения
3. Ценотическая система Ценотическая система — что это такое?
4.   БОЛЕЗНИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ  
5. Система полива
6. 14.6. ИНТЕГРИРУЮЩИЕ СИСТЕМЫ
7. 14.4. КРОВЕНОСНАЯ СИСТЕМА
8. УСТОЙЧИВОСТЬ БОЛОТНЫХ СИСТЕМ
9. Система освещения
10. Физиология вегетативной нервной системы
11. Сердечно-сосудистая система
12.   БОЛЕЗНИ СИСТЕМЫ КРОВИ  
13. Сердечно-сосудистая система
14. 14.6.2. Эндокринная система
15. Кровеносная система глаза.
16. Системы содержания почв
17. Стационарные дождевальные системы
18. Системы низших растений
19. СТРОЕНИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ
20. ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К СИСТЕМАМ ОБЕСПЕЧЕНИЯ