Биохимия апоптоза

Активация цистеиновых (и некоторых других) протеаз — наиболее универсальная черта программируемой клеточной гибели независимо от организма, в котором она происходит. Основные участники программируемой клеточной гибели, каспазы («caspase» от «cysteine aspase») — это семейство эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки по остаткам аспарагиновой кислоты.

В настоящее время идентифицировано 10 каспаз. На основе структурной гомологии каспазы подразделяются на подсемейства 1 (каспазы 1, 4, 5), 2 (каспа- за 2), 3 (каспазы 3, 6-10).
При апоптозе помимо активации цистеиновых протеаз, у растений выявлено возрастание активности сериновой и аспарагиновой протеаз. Интересно, что аспарагиновая протеаза растений в значительной мере сходна с аспарагиновой протеазой, участвующей в программируемой кле-

306 точной гибели Не La линии клеток человека. Кроме того, в апоптозе принимают участие и другие протеазы, прежде всего, кальпаины, или Са2+-за- висимые протеазы и убиквитин (протеаза, ковалентно связывающаяся с белком-мишенью). Эти протеазы — обязательный компонент каскада протеолитических ферментов. Так, ингибиторы кальпаина блокируют апоптоз. Убиквитин-протеосомный путь деградации белков активируется при апоптозе.
Различные протеазы взаимодействуют между собой: последовательно активируют друг друга, участвуют в упорядоченной передаче сигнала апоптоза, могут являться компонентами единого протеазного комплекса (протеосомы). Протеазы образуют целый каскад взаимосвязанных протеолитических реакций. Так, разные протеазы вовлечены в процесс самоубийства клетки и как бы являются мощным разрушительным оружием клетки при самоуничтожении.
Роль каспаз в апоптозе разнообразна. Результатом активности протеаз являются характерные изменения в морфологии клеток при апоптозе. Гидролиз белков ламинов, армирующих ядерную мембрану. Это ведет к распаду ядерной оболочки и конденсации хроматина. Мишенями протеаз при апоптозе являются также белки ядрышек, гистоны и негистоновые белки и топоизомераза. Топоизомераза — связующее звено между ДНК хроматина и белковыми структурами ядра, с помощью которого хроматин прикрепляется к ядерному матриксу. Расщепление топоизомеразы — это этап образования высокомолекулярных фрагментов ДНК. Расщепление антиапоптозных белков — протеолиз ингибитора ДНКазы, ответственной за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоп- тозная ДНКаза CAD {caspase-activated DNase) образует неактивный комплекс с ингибитором lCM,wm DFF (DNA fragmentation factor). При апоптозе ингибитор Гмс участием каспаз 3 и 7 инактивируется и свободная CAD, вызывая нуклеосомные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах — 180-200 пар нуклеотидов. Эти фрагменты и дают характерную лесенку ДНК при электрофоретическом разделении в агарозном геле. Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК. Обнаружен ядерный белок ACCINVS (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus), который при комбинированном действии каспазы 3 и неидентифицированной протеазы расщепляется на фрагменты. Один из них в присутствии дополнительных неядерных факторов вызывает апоптотическую конденсацию хроматина и фрагментацию ядра (кариорексис) без фрагментации ДНК. Кроме непосредственной активации нуклеаз, протеазы (путем ограниченного протеолиза) устраняют структурное разобщение между нуклеазами и ДНК в составе хроматина, удаляют белки, защищающие ДНК. Угнетение репарации ДНК: инактивирование и нарушение регуляции белка, участвующего в репарации ДНК, а также в сплайсинге мРНК, реп-

ликации ДНК. Мишенью каспаз является поли-(АДФ-рибозо)-поли- мераза (ПАРИ), которая участвует в репарации ДНК (катализирует полиАДФ-рибозилирование белков, связанных с ДНК). Донором АДФ- рибозы является NAD'. Активность ПАРП-полимеразы возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. ПАРП участвует в репарации поврежденной ДНК, регуляции активности эндонуклеаз, поддержании структуры хроматина посредством АДФ-рибози- лирования. Апоптотическая гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами. При массированных разрывах ДНК чрезмерная активация ПАРП, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD*, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по пути некроза. Разрушение белков цитоскелета. Деградация структурных и функциональных белков митотического аппарата. Участие в экспрессии генов. Эта функция связана с протеолизом репрессоров и с образованием пептидов, регулирующих транскрипцию (модификация факторов транскрипции). Субстратом протеаз является, например, гистон, выступающий репрессором генов. Одна из функций протеаз — передача апоптозного сигнала от индукторов апоптоза. Сигналы могут быть трансмембранными, рецептор- зависимыми. Рецепторами служат трансмембранные белки. Протеазы принимают участие либо непосредственно при взаимодействии индукторов апоптоза с рецепторами, либо через активацию протеинки- наз, играющих важную роль в передаче трансмембранного сигнала с целого ряда рецепторов.
Локализация протеаз в различных отделах (компартментах) клетки способствует эффективной трансмембранной передаче сигналов программируемой клеточной гибели. Часть протеаз связаны с мембранами (цитоплазматической, ядерной, мембранами органелл или вакуоли) — это мембраносвязанные протеазы. Другие — находятся в матриксе ядра, цитоплазмы или органелл. Аспарагиновая протеаза растений, по всей видимости, локализована в вакуоли. Предполагается, что сериновые протеазы локализуются в цитоплазме и в ядре. Известно, что в ядрах протеазы могут быть прочно ассоциированы с хроматином и, в том числе, непосредственнно с гистонами. Перемещение протеаз в клетке может сопровождаться их активацией. Например, повышение концентрации Са2+ внутри клетки способствует перемещению Са2+-зависимой протеазы и протеинкиназы из цитоплазмы в мембрану.

При этом происходит автокаталитическая активация неактивных форм протеазы.
Так, активация некоторых протеаз может быть обусловлена увеличением концентрации кальция в клетках, наблюдаемой при разных типах апоптоза (раздел выше). АФК также могут быть непосредственными индукторами активации протеаз. Появление локальных участков однонитевой ДНК активирует, например, ядерные ДНК-зависимые сериновые протеазы, специфичные к гистону.





Множество ветвей сигнальной трансдукции перепроверяет правильность выбранного алгоритма событий на пути к апоптозу, уберегая клетку от бессмысленной гибели. Выявлено несколько механизмов, ограждающих клетку от случайного самоуничтожения с участием протеаз.
• Во-первых, протеазы синтезируются в клетке в неактивной форме, а процессинг неактивных форм протеаз происходит путем автолиза или путем протеолиза другими протеазами. Например, каспазы синтезируются в клетке в виде прокаспазы — неактивного мономера с молекулярной массой 30-50 кДа. Активные формы — тетрамеры, содержащие по две субъединицы: (р 10 — р20)2 (рис. 9.7). Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1-2 % активности зрелой каспазы. Механизм протеолитического само- или перекрестного расщепления (ауто- или транс-процессинга), а затем пространственного сближения ведет к образованию активных каспаз. От прокаспазы отделяется регуляторный N-концевой домен



Рис. 9.8. Структурная гомология между белками, участвующими в активации каспаз у животных и растений, и R-белками растений, (van der Biesen, Jones, 1998). PRF — R-белок томата; RPM1, RPS2 и RPP5 — R-белки Arabidopsis; N — R-белок табака; L6 — R-белок льна; APAF1 — белок человека; CED4 — белок Caenorabtilis elegans;
ОА — домен активизации каспазы


(продомен), а оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (около 20 кДа) и малую (около 10 кДа) субъединицы. Затем происходит ассоциация большой и малой субъединиц. Два гетеродимера образуют тетрамер с двумя каталитическими центрами, работающими независимо. Первоначально концентрация каспаз в клетке ничтожна. Благодаря свойству автокатализа, концентрация активных каспаз может возрастать лавинообразно. Во-вторых, протеазы обратимо взаимодействуют с эндогенными белковыми ингибиторами, образуя неактивные комплексы (латентные комплексы описаны для цистеиновых, Са2+-зависимых и некоторых других протеаз). При действии различных индукторов апоптоза происходит диссоциация неактивных комплексов протеаза-ингибитор. Обратимое взаимодействие Са2+-зависимых протеаз с эндогенными ингибиторами регулируется кальцием. Цистеиновая протеаза связывается ковалентно с ингибитором через дисульфидную связь. Высвобождение и активация каспазы происходит в результате тиол-дисуль- фидного обмена и сопряжена с окислительно-восстановительным состоянием клетки и метаболизмом глюкозы. В-третьих, протеазы могут быть компонентами специальных рецеп- тор-зависимых систем. Так, [рецептор + лиганд + адаптор + прокас- паза] формируют специфический агрегат, в котором происходит активация каспаз. Такой агрегат называют апоптосомой или апоптозным шапероном. Самое интересное, что выявлены консервативные области гомологии (в том числе NB-область) белка адаптера у животных и продуктов генов резистентности у растений, включая томат, арабидоп- сис и табак. Более того, белки похожи структурно (рис. 9.8). Предпо-

310              лагается, что продукты гена резистентности могут играть роль адап
теров в апоптосоме. Таким образом, при узнавании продукта авиру- лентности, по всей видимости, происходит диссоциация апоптосомы и развертывание программы апоптоза.
Продукты генов резистентности, по-видимому, ответственны за эффективность гибели клеток при заражении — узнавание факторов и запуск машины самоуничтожения, за первые (самые важные) шаги на пути к стремительной гибели клетки.
Существует несколько путей реализации программы ПКГ. Путь передачи сигнала: индукторы — рецепторы — адаптеры — каспазы первого эшелона — регуляторы — каспазы второго эшелона. Рецептор взаимодействует с лигандом. Насколько обратима гибель клетки? На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие каспаз первого эшелона. После активации каспазами первого эшелона каспаз второго эшелона путем протеолиза из прокаспаз процесс, запушенный программой смерти, становится необратим. Эти каспазы способны в дальнейшем к самоактивации (автокатализу или автопроцессингу) и активируют фактор фрагментации ДНК на нуклеосомные фрагменты.
Вернемся к митохондриям (см. раздел выше). Апоптотическое изменение митохондрии может индуцироваться окислительным стрессом, повышением концентрации Са2+. При апоптозе из межмембранного пространства митохондрий высвобождаются белки — апоптогенные факторы: Прокаспазы. Цитохром С. AIF {Apoptosis Inducing Factor) — флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа. Будучи добавлен к изолированным ядрам, он вызывает конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК, а при добавлении к изолированным митохондриям — высвобождение цитохрома С и каспазы 9. Высвобождаемый цитохром С вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 {apoptosis protease activating factor-1) образует комплекс с прокаспазой (рис. 9.9). APAF-1 играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы 9 (мультимер- ная арматура А РА F1-цитохром-С-комплексов напоминает пропеллер). Обнаружены ингибиторы высвобождения цитохрома С, блокирующие апоптоз, например, белок Bel. 

Еще по теме Биохимия апоптоза:

1. Методы эволюционной биохимии
2. Истоки эволюционной биохимии
3. Физиология и биохимия микроорганизмов
4. БИОХИМИЯ УСТОЙЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ К ВОЗБУДИТЕЛЮ РАКА 8ТЖСН\ ТШим ЕЛгПОВЮТ1Сим (ЭСШЬВ.) РЕЙС.
5. В. Н. Переверзев. Биохимия гумуса и азота почв Кольского полуострова, 1987
6. 8.2.4. Гибель клеток
7. Глава 23. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
8. Физиология
9. Разработка биохимических основ учения о питании. Открытие витаминов
10. Под ред. Ю. Т. Дьякова. Фундаментальная фитопатология, 2011
11. Формы проявления токсического процесса на разных уровнях организации жизни
12.   УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ (ИСТОЧНИКИ)  
13. ЛЕГЧЕ УСЛЫШАТЬ, ЧЕМ УВИДЕТЬ