Разработка твердыхпрепаративных форм биопрепаратов

Жизнеспособность клеток микроорганизмов и стабильность их свойств при хранении в жидкой культуре (как один из возможных вариантов препаративной формы биопрепаратов) определяются не только условиями хранения, но и особенностями микроорганизма, составляющего основу того или иного препарата.

Необходимость проведения исследований для выяснения однородности и стабильности свойств выделенных штаммов микроорганизмов (антагонистических для препаратов сельскохозяйственного назначения) вызвана чувствительностью бактерий к различным способам хранения и поддержания их при лабораторном и промышленном культивировании.

Изучение выживаемости штаммов р. Pseudomonas в условиях жидкой культуры проводили на среде Кинг ВТ. В каждом из вариантов опыта использовали двухсуточную КЖ в объеме 100 мл. Конические стеклянные колбы объемом 250 мл с КЖ штаммов хранили при разных температурных режимах: в холодильнике (6°), термостате (26°), а также при комнатной температуре (20°). Численность жизнеспособных клеток определяли путем высева тщательно перемешанного содержимого колб на среду МПА из серийных разведений и подсчета выросших колоний.

Для исследования влияния адсорбирующих материалов на жизнеспособность и антифунгальную активность штаммов псевдомонад в качестве носителей использовали оксид алюминия (глинозем) А1203, оксид магния (жженая магнезия) MgO, а также каолин-глину белого цвета, состоящую из природного глинистого минерала каолинита. Материалы-носители стерилизовали сухим жаром при 180° в течение 3 ч. В качестве объекта исследования был выбран штамм Р.

суспензии - 1,2 • 1010 КОЕ/мл. В стерильные материалы вносили КЖ штамма из расчета 30 и 50% по массе и тщательно перемешивали до получения однородной массы стерильным шпателем. Полученные препараты хранили в холодильнике при 6°. Для контроля стерильности носителей перед началом эксперимента, а также для учета численности жизнеспособных клеток на адсорбентах в течение опыта вносили по 1 г навески препарата в колбы со 100 мл стерильной воды, затем содержимое колб перемешивали в течение 40 мин на качалке (п = 100 об/мин) и проводили высев из серийных разведений на МПА.

Для изучения возможности хранения культур на силикагеле за основу был взят метод Д. Перкинса [Методы..., 1982]. Объектом исследования послужил штамм Р. putida ИБ 17. Для приготовления бактериальной суспензии культуру выращивали на косяке МПА в течение 5 дней. Флакон (10 мл), наполовину заполненный силикагелем КСМГ (ГОСТ 3956-76), стерилизовали сухим жаром при 180° в течение 1,5 ч и затем вносили 0,5 мл бактериальной суспензии, полученной смывом стерильным обезжиренным молоком с косяка (титр 1,9 • 109 КОЕ/мл). Содержимое флакона тщательно перемешивали и хранили его в закрытом состоянии в холодильнике при 5°. Проверку жизнеспособности клеток штамма на силикагеле осуществляли путем высева нескольких бусин на свежий косяк МПА. Косяк помещали в термостат при 28° на неделю. О жизнеспособности культуры судили по колониям бактерий, образующимся на МПА вокруг бусин силикагеля.

Метод хранения микроорганизмов в лиофильно-высушенном состоянии - один из наиболее оптимальных способов длительной консервации культур в лабораторных условиях. Целью наших исследований было выяснение вопроса о влиянии лиофилиза- ции на антагонистические свойства культур псевдомонад и азотобактера.

Для подготовки культур к лиофилизации их выращивали на агаризованных средах Кинг В (для штаммов псевдомонад), Федорова (для штаммов азотобактера) сплошным газоном в течение 2 сут.

Далее клетки суспендировали в среде, содержащей 24%-ный раствор сахарозы, разведенный равным объемом соответствующей стерильной питательной среды. В каждую ампулу наливали по 400 мкл суспензии бактерий. Лиофилизацию проводили в течение 20 ч на лиофильной сушилке “Иней 3-2”. Восстановление культур из лиофилизированного состояния и проверку жизнеспо-

собности бактерий проводили в соответствии с рекомендациями, описанными в “Методах общей бактериологии” [1984).

Установлено, что штаммы микроорганизмов Р. aureofaciens ИБ 51, Р. aureofaciens ИБ 6, Р. putida ИБ 17, Р. putida ИБ 56, Pseudomonas sp. ИБ 182; Az. vinelandii ИБ 1, Az. vinelandii ИБ 3, Az. vinelandii ИБ 4 в лиофильно-высушенном состоянии сохраняют длительное время (до полутора лет) свои свойства без потери активности.

Перкинс [Методы..., 1982] ранее сообщал о том, что предложенный им метод хранения на силикагеле пригоден для штаммов, образующих конидии. Проведенные нами исследования показали, что подобный метод консервации культур микроорганизмов может быть использован также и для неспорообразующих видов бактерий. В табл.

Разработана твердая препаративная форма биопрепарата азолен. Экспериментально установлено, что биомасса микроорганизмов Az. vinelandii ИБ 4, адсорбированная на твердом носителе (каолин) при массовом соотношении носителя и культуральной жидкости, составляющем 1 : 0,1-0,03, и подвергнутая вакуумной сушке (остаточное содержание воды - 1-10 мас.%), способна сохранять в течение 4 мес высокий титр микроорганизмов на уровне 1 • 1010 КОЕ/г. При этом антагонистическая активность микроорганизмов по отношению к грибным фитопатогенам остается стабильной величиной.

Время

хранения, мес

С целью оценки выживаемости псевдомонад в жидкой культуре при различных условиях хранения проведены эксперименты для двух штаммов бактерий-антагонистов р.

Для представителя другого вида бактерий р. Pseudomonas - Р. aureofaciens ИБ 51 - наблюдался совершенно иной вариант поведения в жидкой культуре (табл. 50). Показано, что уже через 30-45 сут при комнатной температуре, а также при постоянной температуре 26° штамм полностью утрачивает антагонистические

свойства. Хранение при 6° позволяет до некоторой степени поддержать антифунгальную активность клеток, но тем не менее за 11 мес ее значение снижается по сравнению с исходным приблизительно в 2 раза. Следует отметить, что, несмотря на подобное непостоянство активности данного штамма в жидкой культуре, титр жизнеспособных клеток поддерживался на достаточно высоком уровне (1,9 -8,6 • 1010 КОЕ/мл - исходный титр, через 11 мес хранения 4,9 • 107 КОЕ/мл - при комнатной температуре и • 108 КОЕ/мл - в холодильнике).

Следующий этап работы - изучение различных вариантов хранения штаммов псевдомонад на твердых дисперсных материалах. В качестве адсорбентов использовали оксид алюминия, оксид магния, а также каолин в количестве 50 и 70% от общей массы смеси. В качестве объекта исследования был выбран штамм Р. aureofaciens ИБ 51 - основа биопрепарата Елена.

Установлено, что оксид магния не эффективен для хранения исследуемого штамма. Уже через 0,5 мес эксперимента в данной смеси не удалось обнаружить жизнеспособных клеток культуры (табл. 51).

Ряд экспериментов показал, что жизнеспособность культуры обеспечивали каолин и оксид алюминия (глинозем), который

также получают из каолина. При хранении в течение 3 мес в смеси с оксидом алюминия титр клеток штамма Р. aureofaciens ИБ 51 составлял (1,4 ± 0,5) • 108 КОЕ/г, но антагонистическая активность клеток к этому времени уже была утрачена. После 10 месяцев хранения на глиноземе не удалось обнаружить живых клеток штамма (см. табл. 51).

Наиболее эффективным твердым носителем, с точки зрения длительного поддержания жизнеспособности и активности клеток штамма Р. aureofaciens ИБ 51, оказался каолин при весовом соотношении с КЖ, равном 7:3. Численность клеток бактерий оставалась в течение 10 мес на уровне 9,7 ± 0,5 • 106 КОЕ/г, при этом сохранялась фунгистатическая активность клеток в отношении Bipolaris sorokiniana (табл. 51).

Высокий титр культуры (3,4 ± 0,5) • 108 КОЕ/г без утраты антагонистической активности (размер зон подавления роста гриба 10 мм) оставался стабильным в течение 3 мес, что позволило рекомендовать каолин в качестве компонента биопрепарата Елена.

Таким образом, разработаны твердые препаративные формы биопрепаратов Елена и азолен для защиты сельскохозяйственных растений от болезней.