Лабораторная работа №25. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВАВОДЫ ПО ИЗМЕНЕНИЮ БИОМАССЫ ХЛОРЕЛЛЫ (Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)

Одноклеточные водоросли — одни из наиболее распространенных организмов водной среды. К ним относятся представители самых различных систематических групп: диатомовые, перидини- евые — в морских водоемах, желто-зеленые, зеленые и протококковые, обитающие в пресных водах.

В силу своих физиологических особенностей одноклеточные водоросли обладают наибольшей чувствительностью к изменениям внешней среды. Короткий цикл их развития позволяет проследить на нескольких поколениях действие токсических веществ. Одноклеточные водоросли используются для биотестирования широкого класса веществ (тяжелые металлы, хлор и фосфорорганические соединения, ПАВ, детергенты), сточных вод различных отраслей народного хозяйства, загрязненных природных вод и грунтов.
Метод биотестирования по выживаемости Chlorella vulgaris в загрязненном водоеме включен в Международные стандарты ИСО 14000.
Chlorella vulgaris — одноклеточная зеленая водоросль, постоянно присутствующая в природных биоценозах. Размер клеток 0,05 мм, поверхность гладкая, содержит пигменты хлорофилл и каротин, размножается автоспорами. Ch.vulgaris — активный продуцент биомассы, период генерации 19,5 ч, легко культивируется в лабораторных условиях, устойчива к микробному загрязнению, чувствительна к действию различных токсикантов. Кроме того, характеризуется устойчивостью морфологических признаков, что облегчает учет дегенерированных форм, возникающих под влиянием токсикантов.
В лабораторных условиях хлорелла растет на жидких и агаризо- ванных средах. Жидкую питательную среду после стерилизации охлаждают и в стерильных условиях разливают по колбам. Культивирование водорослей осуществляют в колбах объемом 250—300 мл либо в специальных культиваторах. Инокулят вносят в среду из расчета 106 клеток на 1 мл среды. После инокуляции колбы закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками и сверху прикрывают стерильными бумажными колпачками. Выращивание водорослей проводят при постоянной аэрации в люминостатах или на специально оборудованных стеллажах, оснащенных лампами дневного света (интенсивность 2 000—2500 лк), установленных над верхней полкой и под каждой нижеследующей.
Для хранения водорослей в лабораторных условиях используют агаризованную среду Тамия, скошенную в пробирках или разлитую по чашкам Петри. При культивировании водорослей на поверхности агаризованной среды применяют стандартные микробиологические методы: посев штрихом с помощью бактериологической петли или равномерное распределение шпателем суспензии по поверхности агара. Состав среды Тамия (г/л): KN03 — 5,0; MgS04 - 2,5; КН2Р04 - 1,25; FeS04 - 0,003.
Для биотестирования водной среды с использованием СИ. vulgaris предложены тест-реакции, основанные на изменении по

казателей выживаемости, численности, содержания хлорофилла в клетках при культивировании на питательных средах в течение 24 ч (табл. 25.1).
В основу метода определения качества воды, предложенного в лабораторной работе, положены следующие тест-реакции одноклеточных водорослей: изменение численности клеток и их морфологических признаков, учет живых и мертвых клеток, содержание фотосинтезирующих пигментов. Эти параметры могут служить надежной основой для количественной оценки угнетения или стимулирующего влияния сточных вод. Идентификацию живых и мертвых клеток производят по характерным морфологическим изменениям, возникающим под влиянием загрязняющих веществ. К числу признаков мертвой клетки относятся: альбинизация, лизис, появление уродливых форм и т.д. Подсчет клеток проводят в камере Горяева (рис. 25.1) под микроскопом с увеличением 320 (объективом х 40).
Внимание! Камера имеет нужный объем, если покровное стекло правильно притерто, т.е. видны радужные кольца! Камера должна быть очень чистой, а главное обезжиренной, чтобы стекло удалось притереть (можно протереть ее спиртом, чтобы удалить жир).
Принцип действия камеры Горяева
В камере горизонтальные и вертикальные линейки образуют 15 рядов и 15 столбцов, т.е. 225 клеток. Чтобы дважды не сосчитать число особей в одной и той же клетке, передвигают камеру в поле
Таблица 25.1
Тест-реакции СМ. vulgaris при комплексной оценки токсичности
водной среды

№ п/п	Тест-реакция	Показател ь токсичности	Время отклика, ч
1	Выживаемость клеток	Статистически достоверное увеличение единичных нежизнеспособных клеток, которые не делятся и не образуют микроколоний на агаризованных средах	24
2	Изменение численности	Статистически достоверное изменение численности клеток	24
3	Определение живых и мертвых клеток	Наличие клеток с характерными морфологическими изменениями	24
4	Содержание фотосинтезирующих пигментов	Содержание в водорослях хлорофилла а	24

Рис. 25.1. Схема камеры Горяева

зрения микроскопа так, как показано на схеме (рис. 25.2), и просчитывают клетки ряд за рядом. Если концентрация клеток большая, то не надо просматривать всю камеру. Достаточно просчитать 2—3 ряда или насчитать 200—300 клеток. Содержание клеток в среде определить по формуле:
где п — количество клеток в 1 мкл среды; а — количество клеток, подсчитанных в объеме камеры; б — количество больших квадратов камеры, где подсчитывались клетки; в — разведение.
В результате роста и развития организмов в водоемах непрерывно нарастает биомасса. Этот процесс называется биологическим продуцированием, а вновь создаваемая биомасса — биологической продукцией. Биологическое продуцирование происходит в форме образования первичной и вторичной продукции, под которой понимается соответственно прирост биомассы ав- тотрофов и гетеротрофов. Само явление биологического продуцирования можно рассматривать в двух аспектах: как свойство популяций и водоемов, соответственно чему различают биологическую продуктивность популяций и водоемов. Биологическая продуктивность популяций определяется их видовыми особенностями и условиями существования. Под биологической продуктивностью водоемов понимается их свойство обеспечивать тот или иной темп воспроизводства организмов. Так, в сельском хозяйстве говорят о плодородии почв, их способности давать тот

или иной урожай, хотя он в значительной степени зависит не только от качества почвы. Таким образом, биологическая продуктивность популяций и водоемов — это разные аспекты одного явления.
Первичная биологическая продукция образуется в водоеме за счет процессов фотосинтеза, осуществляемого организмами, содержащими светопоглощающие пигменты, и в первую очередь хлорофилл а.
Цель работы — оценить прирост биомассы и численность водоросли Chlorella, культивируемой в загрязненной нефтепродуктами воде.
Оборудование, материалы и реактивы:
колбы конические на 250 мл; колба Бунзена; фильтры 0,25 мкм; фарфоровая ступка с пестиком; центрифуга с центрифужными пробирками на 10 мл; концентрационный фотоколориметр, или фотометр КФК; кюветы 1 см; водоструйный насос; пинцет; мерные цилиндры на 10 и 50 мл; камера Горяева; MgC03; 90 %-й водный раствор ацетона; среда Тамия для культивирования водорослей; нефтепродукты (бензин, нафтеновые кислоты); культура водорослей Chlorella vulgaris.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ Приготовить среду Тамия с концентрацией нефтепродуктов 0,5; 0,05 и 0,005 мг/л (см. табл. 14.1). Сконцентрировать культуру водорослей Chlorella на центрифуге до 106 клеток/мл. Приготовить серию последовательных разведений нефтепродуктов в среде Тамия и разлить среду по 100 мл в конические колбы. В контрольную колбу налить 100 мл среды Тамия без нефтепродуктов в двух повторностях. В каждую колбу добавить по 1 мл концентрированной суспензии водорослей. Колбу Бунзена подсоединить к водоструйному насосу. В воронку поместить фильтр с диаметром пор 0,25 мкм.
Внимание! Перед фильтрованием для предотвращения разрушения пигментов из-за повышения кислотности в экстрактах фильтр покрывают слоем MgC03 из расчета 10 мг на каждый 1 см2 фильтрующей поверхности. Чтобы уменьшить возможные потери от частичного разрушения нежных форм фитопланктона, фильтрацию следует проводить при небольшом разрежении, не превышающем 2/3 атм. Контрольную пробу первой повторности использовать как нулевую точку. Все остальные пробы поставить в люминостат на 24 ч.
В контрольной пробе провести подсчет численности клеток водоросли, зафиксировав количество живых и мертвых. Данные занести в табл. 25.2. Затем содержимое контрольной колбы первой повторности профильтровать через мембранный фильтр диаметром 25 мм с размером пор 0,25 мкм. После окончания фильтрации сразу же провести экстрагирование фильтра без его подсушивания, чтобы свести к минимуму потери от разрушения пигмента. В качестве растворителя использовать 90 %-ный водный раствор ацетона (можно метанола). Экстракция пигментов ацетоном для некоторых водорослей менее эффективна, чем экстракция метанолом, однако спектральные характеристики пигментов в ацетоне изучены несравненно лучше, чем в метаноле.
Примечание. Хранение подсушенных фильтров допускается в течение нескольких дней или недель (до 2 мес) в присутствии силикагеля, в темноте при / = 1 "С. Потери пигмента при этом могут достигать 10—15 %. Для экстракции фильтр осторожно взять пинцетом, поместить в фарфоровую ступку, залить 2—3 мл 90%-го ацетона и растирать в течение 1 мин. Полученную смесь перенести в центрифужную пробирку, добавить 90%-го ацетона до объема 10 мл и выдержать в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин.
Внимание! Во все пустые центрифужные пробирки налить по 10 мл дистиллированной воды, предварительно подписав анализируемые. Центрифугирование экстракта провести в течение 10 мин при 2 000 об/мин. Прозрачный супернатант из анализируемой пробирки перенести в кювету фотоколориметра толщиной 1 см. Определение концентрации хлорофилла проводят по регистрации оптической плотности, полученной в области красного максимума поглощения (663—665 нм). Провести три измерения на фотоколори-
Таблица 25.2
Тест-реакции Chlorella vulgaris (СЫ«) в контроле и тестируемой среде

№ опыта	Численность, кл.	Содержание СЫ а, мкг/мл	Биомасса, мг/л	Содержание мертвых клеток (% от контроля)	Время отклика, ч
Контроль					0
Среда					24

метре, используя среднее значение для расчета концентрации хлорофилла. Для расчета содержания хлорофилла а используют следующие простые соотношения между его концентрацией в мкг/мл растворителя и оптической плотностью Z)665, измеренной при 665 нм в кювете толщиной 1 см:
(1)
где СЫ0 — концентрация хлорофилла а, соответствующая длине волны 665 нм, мкг/мл; 11,9 — пересчетный коэффициент; D665 — оптическая плотность. Данные по оптической плотности и концентрации хлорофилла занести в табл. 25.2. Фотоколориметрирование экстракта следует также провести при 750 нм для учета неспецифического поглощения, вызванного наличием в экстрактах посторонних частичек. Величину неспецифического поглощения следует вычесть из изменений спектра до того, как результат измерений оптической плотности при 665 нм будет использован в уравнении для оценки содержания хлорофилла. Рассчитать концентрацию хлорофилла а по формуле

гдlt;— концентрация хлорофилла а, мкг/мл; 11,9 — пересчетный коэффициент; Z)665, Д750 — оптическая плотность.
Данные занести в табл. 25.1 (п.9). По данным концентрации хлорофилла а рассчитать ориентировочную величину биомассы фитопланктона.
Известно, что концентрация хлорофилла а соответствует примерно 2,5 % от сухой биомассы, или 6,75 % от содержания органического углерода, т.е. при переходе от концентрации хлорофилла а к биомассе, выраженной в единицах углерода (мкг С/л), допустимо использовать пересчетный коэффициент 15, тогда
(3)
где Вс — биомасса фитопланктона, мг/л; 15 — пересчетный коэффициент;— концентрация хлорофилла а. Данные по биомассе занести в табл. 25.2. Через 24 ч культивирования в люминостате провести определение численности и прироста биомассы Chlorella во всех пробах воды, содержащих и не содержащих нефтепродукты, в соответствии с пп. 7—19. Провести сравнительный анализ полученных результатов, учтя численность и биомассу в нулевой контрольной пробе.

Оценка степени загрязнения природного водоема по биомассе фитопланктона

Показатель	Классы качества воды
Показатель	предельно чистая	чистая	удовлетвори тельной чистоты	загрязненная	грязная
Биомасса фитопланктона, мг/л	lt;0,1	о т о	1,5-5,0	5,1-50,0	gt;50

Приведенный в лабораторной работе метод оценки биомассы планктонных водорослей хлорелла по концентрации хлорофилла в клетках моЗкно применять для оценки степени загрязнения природных водоемов, используя табл. 25.3.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Методы биотестирования вод / под ред. А. Н. Крайнюковой. — Черноголовка: Ин-т химической физики АН, 1988.
Пашков Е.В. Международные стандарты ИСО 14 000. Основы экологического управления / Е.В.Пашков [и др.]. — М.: ИПК Стандарты, 1997.
Федоров В.Д. О методах изучения фитопланктона и его активности. — М.: Изд-во МГУ, 1979.
Федоров В.Д. Изменения в природных биологических системах / под ред. В. Н. Максимова. — М.: РАГС, 2004.

<< | >>

Источник: О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование : учеб, пособие для сгуд. высш. учеб, заведений. 2007

Еще по теме Лабораторная работа №25. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВАВОДЫ ПО ИЗМЕНЕНИЮ БИОМАССЫ ХЛОРЕЛЛЫ (Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой):

- Геоэкология - Основы экологии - Экологический мониторинг - Экология животных - Экология насекомых - Экология почв и агроэкология - Экология птиц - Экология рыб -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -