Исследование генов устойчивости методами молекулярной генетики

Молекулярное исследование флоровских генов устойчивости — несравненно более трудная задача, чем исследование генов авирулентности паразитов. Продукты генов устойчивости, — гипотетические рецепторы, не известны и не могут служить молекулярными зондами, подобно белку — специфическому элиситору Cladosporium fulvum.

Огромный размер генома высших растений делает невозможным выделение гена устойчивости такими методами, как тотальная проверка клонов из библиотеки генов. Поскольку не известно, увеличивается ли экспрессия R-генов при заражении, к их изучению неприменимы методы, связанные с выделением фазоспецифических фракций л/РНК. Поэтому к клонированию R-генов и изучению структуры их продуктов ученые шли более сорока лет, и появившиеся к середине 90-х гг. прошлого столетия первые сообщения на эту тему вызвали большой интерес.
Молекулярные методы, использующиеся для исследования взаимоотношений растений и их паразитов
Для изоляции генов устойчивости из разных растений были применены следующие методы и их сочетания: Использование видов растений, имеющих небольшой размер генома, таких как лен и, особенно, арабидопсис (размер генома Arabidopsis

составляет 1 х 108 пар нуклеотидов, льна — 7 х 108 пар, пшеницы — 255 1,7 х Ю10 пар). Маркирование генов устойчивости перекрывающимися сегментами разрезанной рестрикционными ферментами (рестриктазами) ДНК (RFLP-локусами) в расщепляющемся потомстве F2. Маркирование локусов устойчивости транспозоновым мутагенезом. Использование радиоактивно меченного специфического элиситора в качестве зонда для выделения рецептора и реконструкция кодирующего гена по структуре его продукта.
В настоящее время арсенал методических прием значительно вырос по сравнению с концом XX в., поэтому мы считаем необходимым остановиться на современных приемах исследования взаимодействия растений с паразитами.
Заинтересованный читатель найдет здесь методический инструмент (хотя весьма схематический и краткий) для использования на практике полученных теоретических знаний об устойчивости растений. Будет раскрыта лишь суть методов, что даст возможность читателю получить общее представление о лабораторной кухне, наборе доступных методов, применяющихся для выяснения роли различных протеинов в передаче сигнала (включая СВЧ сигнал), пути их активации и взаимодействия; или для определения значения регуляторных последовательностей в контроле реакций клетки (например, апоптоз), для поиска генов и маркеров в селекции на устойчивость.
Эпитопные метки
Эпитопные метки, такие как FLAG, c-myc, НА, V5 широко применяются для отслеживания экспрессии гена, локализации белка в клетке, его идентификации, выделения и очистки. Метод позволяет выделять протеиновые комплексы или белки, состоящие из нескольких субъединиц.
В основе метода лежит применение антител для специфического узнавания и связывания белков, содержащих метки-эпитопы (иммунологический подход). В качестве эпитопной метки используют короткий полипептид, 3D структура которого хорошо узнается иммунной системой (антителами, В или Т клетками).
Для использования этой технологии создается рекомбинантная ДНК (химерный ген с помощью стандартных молекулярных методов), в которой часть молекулы — это изучаемый ген, другая часть — антигенная детерминанта (эпитоп). Так, ген помечается эпитопом для специфического связывания с антителами; это метка будет способствовать изучению белка иммунологическими методами (обнаружение в клетке, выделение и очистка).
Применение эпитопной метки позволяет обойти стадию получения антител на конкретную молекулу, а вместо этого предоставляет возможность использовать стандартный метод и готовые антитела на метку.

256 Примером может служить FLAG-метка — это пептид N-DYKDDDDK-C
(1012 Да). Структура метки оптимизирована для широкой совместимости с различными протеинами. Гидрофильные свойства метки снижают вероятность дезактивации белка и являются преимуществом этой метки по сравнению с другими распространенными метками. После выделения рекомбинантного белка, эпитоп отделяется при помощи энтеропептидаз, высвобождая изучаемый белок.
В дополнение к методу эпитопной метки, другим молекулярным меткам могут применяться иммунофлуоресцентные методы, которые помогают визуализировать молекулы. Так, с помощью стандартных методов создания рекомбинантной ДНК может быть создан рекомбинантный протеин, частью которого является флуоресцирующий домен (например GFP). Можно также использовать как первичные так и вторичные флуоресцирующие антитела, но как правило флуорофор присоединяют к вторичным антителам. Иммунофлуоресцентный метод, который называется FISH (Fluorescence in situ hybridization), может также применяться для физического картирования — для определения локализации специфической последовательности ДНК на хромосоме на основе использования флуоресцентных проб, которые гибридизуются с гомологичными участками ДНК на хромосоме.
Двугибридный скрининг (Y2H)
Y2H скрининг используется для изучения роли белков в сигнальной сети клетки и в биохимических процессах. Этот метод обеспечивает эффективное тестирование физического связывания между протеинами и протеинами-ДНК, и, следовательно, тестирование функциональных взаимодействий молекул в клетке.
Метод предоставляет возможность скрининга на взаимодействие изучаемого белка с большими библиотеками или индивидуальными белками, как известными так и неизвестными. Например, можно протестировать все экспрессированные белки организма и выяснить характер их функциональных взаимодействий с индивидуальным белком.
Для этого метода конструируются две плазмиды. Продукт одной плазмиды — это белок «приманка», в котором протеин слит с доменом ДНК-свя- зывания. Этот белок используется для идентификации новых молекулярных «партнеров» для связывания. Продукт другой плазмиды — это протеин «жертва», который содержит домен активации транскрипции. Посредством трансформации обе плазмиды одновременно попадают в клетки специальных штаммов дрожжей.
Для активации транскрипции гена необходимо успешное взаимодействие протеина «приманки» и протеина «жертвы». Если «приманка» и «жертва» взаимодействуют (физически связываются), транскрипция активируется, ген-репортер работает. Успешное взаимодействие белков с последующей транскрипцией гена-репортера вызывает изменение фенотипа клетки- хозяина.

В качестве клетки-хозяина используется генетически измененный 257 штамм дрожжей, например ауксотрофный мутант, в котором нарушен биосинтез аминокислот. Такие дрожжи не будут выживать на среде без добавления аминокислот. Мутантный штамм будет расти на такой среде только в случае успешного взаимодействия белков «хищник» и «жертва». Так, по изменению фенотипа можно судить об успешном функциональном взаимодействии молекул в клетке.
«Тайлинг» технология
Основная цель применения этого метода — выявление новых транс- криптов или ранее не идентифицированных форм альтернативного сплайсинга. Тайлинг скрининг можно проводить в масштабе всего генома. Метод также помогает раскрыть структуру генов и белков, найти специфические сайты связывания с другими молекулами. Тайлинг является одним из наиболее эффективных и широко применяемых методов молекулярной генетики сегодня.
Наличие транскрипта говорит о том, что ген является активным и, если в клетке есть транскрипт гена, то такой ген можно идентифицировать на основе гибридизации с готовыми пробами, ДНК фрагментами известными по результатам сиквенса генома.
Суть метода состоит в гибридизации готовых «тайлинг» проб (десятки тысяч коротких и перекрывающимися ДНК фрагментов, зафиксированных на поверхности биочипов) с меченными ДНК фрагментами клетки, предварительно полученными копированием транскриптов (РНК) с помощью серии стандартных молекулярных методов, включая выделение РНК, копирование в двуцепочечную ДНК, амплифицирование и in vitro транскрипция, получение меченных ДНК фрагментов.
Положительные и отрицательные сигналы гибридизации сканируются и анализируются с помощью компьютера. Положительные сигналы (позитивная гибридизация известной пробы и ДНК фрагмента клетки) идентифицируют активные гены, работающие в изучаемых клетках в условиях конкретного эксперимента.
Технология «Дисплей»
«Бактериофаг-дисплей», «Бактерия-дисплей», «Дрожжи-дисплей», «мРНК-дисплей», «Рибосома-дисплей» — группа методов, использующихся для изучения функций белков и механизмов взаимодействия белок- белок или белок-ДНК. Дисплей широко используются для поиска новых лигандов, ингибиторов ферментов и рецептор-лиганд сочетаний. С помощью этих методов можно тестировать большие библиотеки протеинов.
Суть методов дисплеев можно рассмотреть на примере метода «Бактериофаг-дисплей». ДНК, кодирующая протеин, присоединяется (лигируется) к гену бактериофага, и построенный ген-гибрид вводится с помощью метода трансформации в Е. coli. В бактериальной клетке ген транскрибируется, и белок-продукт высвобождается из клетки.

258 Для высвобождения баетериофага из бактериальных клеток, эти клетки
инфицируются бактериофагом-помощником, который способствует упаковке ДНК и созреванию вириона. Стадия использования бактериофага-помощника может быть исключена при применении новой бактериальной линии, что значительно упрощает технологию.
Лигированием различных фрагментов в гены бактериофага можно создавать библиотеки генов для последующего скрининга. Бедки дисплея тестируются на взаимодействие с пробами. Протеины дисплея, не связавшиеся с пробами, смываются и удаляются. Если белок дисплея взаимодействует с готовой пробой ДНК или протеина, то связавшиеся протеины могут быть выделены и идентифицированы путем секвенирования. При выделении происходит постепенное обогащение образца этими молекулами. Вся процедура очищения связавшихся молекул дисплея и пробы может сравниться с обогащением образцов золота путем циклического отмывания его от загрязнений.
Технология «Микроэррей» (microarray)
«Микроэррей белков», «микроэррей ДНК», «микроэррей белкового связывания», «микроэррей клеток», «микроэррей антител», «микроэррей тканей», «микроэррей экспрессии генов» — группа методов, использующиеся для идентификации биологических мишеней (белков, транскриптов и прочее). Микроэррей — это эффективная система обнаружения. Примерами могут служить идентификация взаимодействия белок-белок, субстратов протеиновых киназ, транскрипционных фаююров, белков мишеней регуляторных молекул, или анализ экспрессии генов (профиль экспрессии).
Применение микроэррей значительно ускорило развитие многих областей биологических исследований, в том числе исследования в области молекулярных взаимодействий между растением и паразитом. Микроэррей широко используется для идентификации генов растений, активированных или ингибированных в ответ на заражение патогенном и вовлеченных в СВЧ.
Механизм работы микроэррей можно рассмотреть на примере ДНК микроэррей. ДНК микроэррей состоит из серии многочисленных микроскопических образцов олигонуклеотидов ДНК (проб), содержащих пикомоли специфических меченых ДНК последовательностей, нанесенных на специальный матрикс, или платформу. Платформа может быть гладкой или состоящей из многочисленных микроскопических шариков. Пробы прикрепляются к поверхности химического матрикса (например полиакриламидного) с помощью ковалентной связи. Поверхностью для закрепления проб может быть силиконовый или стеклянный биочип. Наиболее распространены биочипы американской компании Affymetrix.
Для того чтобы провести сравнительный анализ экспрессии генов в инфицированном растении и экспрессии генов в неинфицированном здоровом растении и так идентифицировать гены изменяющие уровень экспрессии после инфицирования (компоненты системы защиты растения, участвующие в механизме отклика растения на внедрение патогенна), сначала

необходимо выделить РНК из двух образцов растений (контрольного и зараженного). Затем путем обратной транскрипции с участием РНК-зависи- мой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы) с матрицы РНК копируется комплементарная ДНК (кДНК).
Далее из двух образцов кДНК готовятся различно окрашенные флуоресцентные пробы. Для этого, как правило, используют зеленые и красные флуорофоры: СуЗ (излучение соответствует зеленой части спектра) и Су5 (излучение соответствует красной части спектра). Затем СуЗ и Су5 образцы смешиваются и гибридизуются с одним микроэррей. Два образца легко различить в реакционной смеси и провести количественный анализ. Относительная интенсивность каждого флуорофора сканируется и анализируется с помощью компьютера. Полученные данные используется для идентификации генов активированных или ингибированных при заражении.
DArT (Diversity Arrays Technology)
Эта технология применяется для мониторинга состава популяций, оценки генетического разнообразия, идентификации сортов, идентификации количественных локусов (QTLs) и маркеров для селекции, анализа генома (профиль генома) и быстрого построения генетических карт. Причем этот метод не требует знание последовательностей ДНК, а основывается на выявлении полиморфных ДНК фрагментов.
Полиморфные фрагменты являются информативными для генетического анализа и отражают изменчивость последовательностей. Именно такие фрагменты отбираются для создания библиотеки вида (геномной репрезентации).
Сначала подготавливаются ДНК пробы. Для этого проводится рестрикция ДНК и присоединение адаптеров (лигирование). Полученные фрагменты ДНК разделяются на две группы — неполиморфные и полиморфные фрагменты.
Полиморфные фрагменты отбираются для создания геномной репрезентации, или библиотеки, с помощью стандартных молекулярных методов (клонирование фрагментов и трансформация в Е. coli).
Фрагменты ДНК библиотеки амплифицируются, метятся синим флуоресцентным красителем (флуорофором) и наносятся на стеклянные слайды, образуя микроэррей для генетипирования (DArT чип).
Эти чипы используются для гибридизации с индивидуальными образцами ДНК («ДНК мишенями»), подготовленными также с использованием метода геномной репрезентации, и меченными, в отличии от ДНК проб, зеленым флуорофором. Чипы сканируют, и измеряют интенсивность флуоресцентного свечения для каждого маркера.
Методы ингибирования экспрессии генов («Knockdown»)
Для ингибирования экспрессии широко применяется технология «Интерферирующая РНК» (РНКи).

Метод «интерферирующей РНК» основан на использовании коротких двуцепочечных РНК, комплементарных изучаемому гену, которые вызывают временное посттранскрипционное молчание этого гена без мутации ДНК. Метод позволяет значительно ингибировать экспрессию изучаемого гена («knockdown»), в отличии от методов «knockout», когда экспрессия гена полностью подавлена. Метод нашел широкое применение для изучения функций генов, последовательности которых секвенирова- ны, а функции малоизученны или неизвестны. иРНК также используется для широкомасштабного скрининга с системным селективным ингибированием большого набора генов, помогающим раскрыть молекулярные компоненты, необходимые для специфических клеточных процессов, таких как апоптоз.
Для этого метода синтезируется двуцепочечная РНК, комплементарная изучаемому гену. Попадая в клетку, эта РНК узнается внутриклеточными механизмами как чужеродный генетический материал и активирует деградацию мРНК (транскрипт гена).

Изучая фенотипическое проявление снижения экспрессии гена, можно судить о роли белка в клетке. иРНК является примером серии методов для «knock-down» генов. Помимо РНКи применяются и другие короткие некодирующие ДНК или РНК олигонуклеотиды с последовательностями комплементарными гену или мРНК транскрипту (антисмысловыми последовательностями), которые блокируют трансляцию, транскрипцию, сплайсинг или нуклеазную активность при созревании функциональной РНК. Кроме РНКи, два других типа методов широко используются для «knock-down» генов.
Во-первых, химически модифицированные синтетические антисмысловые олигонуклеотиды, в которых атомы кислорода замещены на серу (S-DNA). Такая химическая модификация делает олигонуклеотиды устойчивыми к деградации в клетке с участием нуклеаз ДНК. Недостатком этого метода является довольно-таки низкая специфичность. Так как модифицированная ДНК содержит серу, за счет атомов серы эти олигонуклеотиды могут связываться с различными протеинами помимо протеина- мишени.
Во-вторых, Morpholino антисмысловые олигонуклеотиды. Эти олигонуклеотиды обладают высокой стабильностью, электростатически не взаимодействуют с белками, не являющиеся мишенями, следовательно, не имеют сильных побочных эффе1сгов. Они также обладают высокой специфичностью: 14-15 оснований должны совпадать с молекулой-мишенью для связывания и последующего блокирования транскрипции гена, следовательно, отобранный транскрипт (мРНК) будет уникальной мишенью для блокирования гена.
Важная группа молекулярных методов, так же как и ингибирование экспрессии генов, предназначенных для выявления функций белков, — методы повышения экспрессии генов — Методы «Сверх-экспрессии». Примерами могут служить искусственные системы экспрессии и индуци- бильные (активируемые) промоторы, обеспечивающие надежную регуля-

цию транскрипции, для изучения экспрессии генов. Синтез протеина в по- 261 вышенной концентрации и усиление проявления признака можно вызвать с помощью увеличения числа копий гена или усиления промотора (например, используя дополнительные энхансеры, или усилители промотора).
Эти стратегии, однако, не всегда приводит к продуцированию функционального протеина.
С помощью транспозонной метки (транспозонного инсерционного мутагенеза) и Т-ДНК инсерций возможно создание больших коллекций мутантов, в которых активация транскрипции и усиление признаков вызвана случайной доминантной мутацией в неизвестном гене. Скрининг такой коллекции мутантов позволяет отобрать растения с измененным фенотипом, например, с повышенной — в сравнении с диким типом — устойчивостью к изучаемому паразиту. TAIL (Thermal Asymmetric Interlaced)
ПЦР помогает идентифицировать сайт интеграции и выделить неизвестные последовательности, примыкающие к т-ДНК или транспозонной ин- серции. Так идентифицируется гены, участвующие в усилении устойчивости к заболеваниям.
Маркеры
Ниже приводится краткая характеристика молекулярных маркеров, которые используются для выявления генов устойчивости растений, а также генов вирулентности паразитов. Анализ молекулярных маркеров (геноти- пирование) ведется параллельно с анализом расщепления фенотипических признаков в генетических популяциях (фенотипированием).
Молекулярные маркеры могут применяться как для качественного, так и для количественного генетического анализа. Качественный анализ устанавливает связь между маркером и геном, ответственным за качественный признак. Количественный анализ определяет связь между маркерами и локусами, связанными с количественными признаками (например, количественная, или полевая устойчивость).
AFLP (полиморфизм длин амплифицированных фрагментов,
Amplified Fragment Length Polymorphism) маркеры
AFLP является одним из вариантов ДНК фингерпринтинга и широко применяется для картирования генов устойчивости растений, а также генов вирулентности паразитов, в особенности, в случаях низкого генетического полиморфизма. Технология характеризуется достаточно высокой чувствительностью и воспроизводимостью; кроме того, отсутствие данных по сик- венсу изучаемых последовательностей не ограничивает использование маркеров.
Этот метод основан на изучении полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК у генетических популяций (F2, F3, бэккросс и прочее). Метод проводится в три этапа. Рестрикция : получение фрагментов ДНК с участием рестрикционных эндонуклеаз; лигирование: присоединение спе-

262 цифических адаптеров с обоих концов полученных фрагментов; амплификация: получение множественных копий рестрикционных фрагментов с использованием ПЦР праймеров, комплементарных присоединенным адаптерам. 50-100 фрагментов ДНК амплифицируются за один опыт. ДНК фрагменты разделяются на длинных полиакриламидных гелях или капиллярах, в случае капиллярного электрофореза, и проводится анализ полиморфизма. Несмотря на широкое использование, метод является весьма сложным и медленным и не подходит для широкомасштабного скрининга.
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) маркеры
Эти маркеры, в основном, используются для картирования, генетического анализа, оценки генетического разнообразия популяций, фингерприн- тинга и изучения хромосомной локализации генов.
Метод включает рестрикцию геномной ДНК, электорофоретическое разделение рестрикционных фрагментов, перенос этих фрагментов с геля на мембрану (Саузерн) и затем гибридизацию с радиоактивной или флуоресцентной пробой.
Гены устойчивости были впервые картированы с использованием RFLP. Однако сейчас эти маркеры не так уж широко применяются в селекции растений, так как для использования этого метода необходимо большое количество исходной геномной ДНК, и метод уступает другим современным технологиям по простоте использования и затраченным времени и средствам — включает рестрикцию, Саузерн и использование радиоактивной или дорогой флуоресцентной метки.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
В отличии от большинства традиционных ПЦР маркеров, RAPD не требует знания специфических последовательностей генетических локусов. В связи с этим метод, в основном, используются для изучения полиморфизма у тех организмов, где гены не секвенированы, и последовательности ДНК неизвестны. Метод является довольно-таки простым и быстрым.
RAPD основан на использовании набора из нескольких коротких неспецифических праймеров (8-12 нуклеотидов) и амплифицировании случайных полиморфных фрагментов ДНК, т. е. выявляет полиморфизм случайных ам- пликонов (ПЦР-продуктов), различающихся по длине последовательностей. Эти маркеры — практически все доминантные, и поэтому с их помощью невозможно отличить гомозиготы и гетерозиготы. Редко встречаются информативные для генетического анализа кодоминантные маркеры.
Для RAPD важна высокая концентрация и хорошее качество исходной геномной ДНК: метод требует длинных фрагментов ДНК в качестве матрицы и не может использоваться в тех случаях, когда ДНК подвергалась деградации.
Метод характеризуется невысокой воспроизводимостью, и результаты опытов трудно интерпретировать. Разные наборы RAPD праймеров отли-

чаются по степени специфичности, а полученные с их помощью данные 263 могут интерпретироваться по-разному.
SCAR (Sequence Characterised Amplified Region)
SCAR — это маркеры, разработанные на основе расшифровки последовательностей RAPD маркеров. Для получения этих маркеров полиморфный ПЦР фрагмент, амплифицированный с помощью набора коротких неспецифических RAPD праймеров, выделяют из геля, клонируют и секвенирует. Расшифрованные ДНК последовательности используют для создания новых ПЦР праймеров — более длинных и специфических для данного локуса. С помощью этих праймеров амплифицируется один специфический локус.
SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Метод широко используется для изучения аллельного полиморфизма.
SNP, полиморфизм единичных нуклеотидов — это тип полиморфизма ДНК, когда изменен единственный нуклеотид (А, Т, С или G) в сравниваемых последовательностях (например при сравнении геномов, хромосом или отдельных генов) у индивидуальных организмов одного вида — иными словами, различие между аллелями составляет один измененный нуклеотид. Каждый индивидуальный организм характеризуется определенным уровнем полиморфизма по единичным нуклеотидам, что вносит существенный вклад в уникальность ДНК последовательностей каждого организма. SNPs имеют в основном только две аллели и отвечают за аллельный полиморфизм.
SNPs растения или паразита могут приводить к изменениям в характере развитии заболеваний растений и в эффективности отклика растения на внедрение патогенного организма. Генетические различия между аллелями может фенотипически выражаться в изменении признаков устойчивость / восприимчивость растения или признаков вирулентность / авирулентность паразита (т. е. изменение одного нуклеотида — одной SNP мутации — может оказаться достаточным, чтобы авирулентный паразит сделался вирулентным или устойчивое растение — восприимчивым).
Для этого метода ПЦР праймеры разрабатывают с учетом измененного нуклеотида; температурный режим ПЦР подбирают эмпирически. SNP выявляют по наличию или отсутствию ПЦР продукта. Кроме ПЦР маркеров, для обнаружения SNP могут применяться другие методы, такие как тест «Вторжения» (Invader assay), помогающий визуализировать SNP маркер; по сравнению с ПЦР маркерами тест имеет ряд преимуществ, прежде всего, он является более быстрым.
SSR маркеры (Микросателлитные маркеры,
Simple Sequence Repeats)
Микросателлиты представляют собой полиморфные локусы ядерной ДНК или ДНК органелл, состоящие из повторяющихся обычно 10-100 раз

264 последовательностей, от 1 до 6 нуклеотидов длиной. Типичный пример — (СА)п, где п — это переменная. Как правило, эти локусы нейтральные и ко-доминантные.
Эти маркеры — достаточно высоконадежные ПЦР маркеры. Метод является относительно простым и может быть автоматизирован. SSR маркеры находят применение для молекулярного картирования, поиска новых генов, определения дозы гена, изучения состава популяций и многое другие.
CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic sequences)
Метод используется для поиска полиморфизма генетических локусов, в том числе локусов, ответственных за устойчивость к заболеваниям. Большинство CAPS маркеров являются ко-доминантными и локус-специ- фическими; генотипы растений легко анализировать и интерпретировать; метод не требует применения радиоактивной метки. Для тестирования CAPS маркеров сначала проводится ПЦР амплификация генетического локуса со специфическими праймерами, а затем рестрикция ПЦР продукта (ампликона) и анализ полиморфизма длин фрагментов, как в методе RFLP.
CAPS — менее полиморфные маркеры, чем микросателлитные маркеры, к тому же, использование рестрикционного анализа делает метод более дорогим по сравнению с применением простых ПЦР маркеров.
ESTs (Expressed Sequence Taggs)
ESTs — короткие (обычно 500-800 нуклеотидов) фрагменты ДНК, комплементарные мРНК и представляют собой участки активных генов, используются для идентификации транскриптов и являются инструментом поиска генов. Для картирования ESTs используется метод FISH (раздел иммуннофлуоресцентные методы).
STS (Sequence Tagged Sites) маркеры
STS — это сайты ДНК длиной 200-500 пар оснований, которые имеют только одну копию в геноме, и последовательности и локализация которых известны. STS используются для построения генетических и физических карт, и их легко обнаружить с помощью ПЦР со специфическими праймерами.
ПЦР маркеры, основанные на полиморфизме последовательностей, широко используются для изучения генов устойчивости и в селекции растений на устойчивость к заболеваниям. STS генов устойчивости — это возможно лучшие маркеры, так как могут использоваться для идентификации самих генов, а не близкосцепленных локусов. В случае если STS полиморфны по длине или нуклеотидному составу у индивидуальных организмов, эти маркеры используются для идентификации этих организмов.
DArT маркеры
Хорошие маркеры для изучения на молекулярном уровне генетического разнообразия между селекционными линиями и сортами. Применение этих маркеров значительно ускоряет селекцию растений.

Маркеры используются для широкомасштабного скрининга. Для этих 265 маркеров характерна высокая воспроизводимость результатов. Хотя метод требует применение сложного оборудования для анализа и интерпретации, затраты на анализ каждого образца невысоки.
Для применения этих маркеров не требуется знание последовательностей ДНК.
Это надежные маркеры, основанные на гибридизации ДНК. Суть технологии создания чипов для рутинного анализа этих маркеров раскрыта выше в разделе DArT технология.
Значение молекулярных маркеров в раскрытии биологической информации можно продемонстрировать на примере, не относящемся к растениям: Европейский суд по правам человека признал, что анализ ДНК является существенным источником личной информации о самом носителе ДНК, о его предках, потомках, близких или дальних родственниках, и поэтому применение ДНК фингерпринтинга (кроме криминальных случаев) может рассматриваться как нарушение прав человека. Использование молекулярных маркеров для идентификации человека лишь один из многих примеров, когда маркеры могут применяться как значительный источник важной биологической информации — у микроорганизмов, растений, животных или человека.
Вышеописанные молекулярные методы, в особенности методы на основе ПЦР, в последние годы интенсивно развивались, были существенно расширены первоначальные области применения, улучшены специфичность и чувствительность, стали применяться безопасные флуоресцентные красители. Ниже приводим краткий список вариантов ПЦР, применяющихся в настоящее время. Количественная ПЦР (Quantitative PCR), ПЦР в реальном времени (Quantitative Real-time PCR), ПЦР специфическая для аллелей, или СНП генотипирование (Allele- specific PCR, SNP genotyping), ПЦР сборки (Assembly PCR), ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR or RT PCR), ПЦР с мини праймерами (Miniprimer PCR), ПЦР с хеликазой (Helicase-dependent PCR), «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR), ПЦР с лигированем линкеров (Ligation-mediated PCR), ПЦР специфическая для метилирования (Methylation-specific PCR), ПЦР твердой фазы (Solid Phase PCR), ПЦР со снижением температуры цикла (Touchdown PCR), «Нестед» ПЦР, или «Вложенная» ПЦР (Nested PCR), ПЦР «Горячий старт» (Hot-start PCR), Ассиметричная ПЦР (Asymmetric PCR), Термально-ассиметричная перекрывающая ПЦР (TAIL PCR or Thermal asymmetric interlaced PCR).

Принципы и возможности использования некоторых из перечисленных вариантов ПЦР были изложены в предшествующих разделах (см. главу 3).

Молекулярные методы быстро совершенствуются, открываются возможности для создания качественно новых методов. Основные направления развития методов — это простота, безопасность и дешевизна использования, усиление специфичности, чувствительности или разрешающей способности, возможность количественного анализа, повышение воспроизводимости результатов, ясность интерпретации, расширение области применения и приемлемость качества исходного материала. В недалеком будущем методы следующего поколения заменят многие из технологий, применяющихся сегодня.

<< | >>

Источник: Под ред. Ю. Т. Дьякова. Фундаментальная фитопатология. 2011

Еще по теме Исследование генов устойчивости методами молекулярной генетики:

- Агрохимия и агропочвоведение - Животноводство и промыслы - Защита растений - Земледелие - Овощеводство - Плодоводство - Пчеловодство - Растениеводство - Сад и огород - Селекция и семеноводство с/х культур - Сельскохозяйственные мелиорации -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -