Лабораторная работа №29. ПРОВЕДЕНИЕТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА ДАФНИЯХ (Лабораторная работа подготовлена О. П. Мелеховой и Е. И. Егоровой на основе методических рекомендаций О. Ф. Филенко)

  Метод биотестирования с использованием дафний широко применяется у нас в стране и за рубежом. Дафнии как обязательный тест-объект включены в схему установления ПДК веществ- загрязнителей и сточных вод в России. Метод может быть применен для определения токсичности химических соединений, сточных вод, а также состояния природных вод.
Род Daphnia (класс Crustacea, отряд Cladocera) включает 50 видов и имеет повсеместное распространение. В пресноводных водоемах России широко распространены следующие виды дафний: Daphnia magna straus, Daphnia pulex De Oeer, Daphnia longispina O.F. Muller.
Рачки вида Daphnia magna имеют более крупные размеры и их применение в токсикологических экспериментах предпочтительнее (рис. 29.1).
Являются типичными бета-мезосапробами, переносят осоло- нение до 6 %.
Короткий биологический цикл развития позволяет проследить рост и развитие дафний на всех жизненных стадиях.
Новорожденная молодь имеет размеры 0,7—0,9 мм в длину, к моменту половозрелости самки достигают 2,2—2,4 мм (максимальная длина тела до 6,0 мм), а самцы 2,0—2,1 мм.
При благоприятных условиях в лаборатории дафнии большую часть года размножаются без оплодотворения, т.е. партеногенети- чески, производя потомство, состоящее из самок.
Период созревания рачков при температуре 20 ± 2 °С и хорошем питании — 5—8 дней. Длительность эмбрионального разви-

Рис. 29.1. Строение Daphnia magna
straus (самка):
1 — антенна; 2 — сложный глаз; 3 — антеннула; 4 — грудные ножки; 5 — яичник; 6 — створки панциря; 7 — каудальные когти; 8 — постабдомен; 9 — хвостовые щетинки; 10 — выводковая камера; 11 — сердце; 12 — кишечник; 13 — печеночные выросты
тия обычно 3—4 дня, а при повышении температуры до 25 °С — 46 ч. По истечении этого времени происходит вымет молоди. Парте- ногенетические поколения следуют одно за другим каждые 3—4 дня. Вначале число яиц в кладке 10—15, затем — до 30—40 и более. Формирование яиц прекращается за 2 — 3 дня до смерти. В природе дафнии живут в среднем 20—25 дней, а в лаборатории при оптимальном режиме — 3—4 мес и более. При температурах свыше 25 °С продолжительность жизни дафний может сократиться до 25 дней.
Концентрация водорослей 0,7—1 млн кл/л в качестве пищи является оптимальной для развития дафний.
Дафния устойчива к изменению кислородного режима (до 2 мг 02 в литре), что связано со способностью синтезировать гемоглобин. В условиях пониженной концентрации растворенного кислорода дафнии приобретают красноватый цвет, а при благоприятных условиях — розовато-желтый цвет.
Работу с дафниями необходимо проводить в помещении, где не используются химические летучие вещества. Недопустима даже обработка помещения хлор- и фосфорорганическими пестицидами для борьбы с насекомыми.
Устойчивые условия культивирования можно обеспечить в застекленном шкафу-термолюминостате с раздвижными передними стеклами и рядом полок для сосудов. В шкафу монтируются лампы дневного света, обеспечивающие освещенность около 400— 600 лк в течение 10—12 ч в сутки. В шкаф может быть встроен
обогреватель с контактным термометром, обеспечивающим температуру (20 ± 2) “С.
Для культивирования дафний используют отстоянную водопроводную воду. Основные гидрохимические показатели воды, используемой для культивирования дафний, должны находиться в следующих пределах: pH 7,0—8,2; содержание кислорода 6 — 8 мг 02/л; окисляемость по Кубелю 4,2 —5,8 02 мг/л; общая жесткость 3,0—6,5 мгхэкв/л (200 ± 50 мг СаСОэ/л); соотношение Ca/Mg 4:1; NH4N02 — следы (тысячные доли миллиграмм N/л). В качестве корма могут служить зеленые протококковые водоросли, выращиваемые на среде тамия.
Исходная концентрация водорослей должна быть около 2 млн кл./л. Через 7 — 10 дней роста в оптимальных условиях культура достигает максимальной плотности. Для кормления дафний водоросли следует отделить от питательной среды центрифугированием или 2 — 3-суточным отстаиванием в холодильнике. Осадок разбавить в 2 раза дистиллированной водой. Суспензия может храниться в холодильнике не более 14 дней. Старые клетки выделяют хлореллин, который угнетает развитие дафний. Кормление дафний проводится 1 раз в день из расчета 1 мл суспензии (плотность 600 — 1 000 млн кл./мл) на 1 л воды. Один или два раза в неделю дафний можно подкармливать пекарскими или кормовыми дрожжами из расчета 3 мл 1 %-й суспензии на 1 л культуральной среды.
Дафний культивируют в стеклянных кристаллизаторах объемом 2 —5 л при плотности посадки не более 25 особей на 1 л воды. Переносить дафний удобно автоматической пипеткой со срезанной узкой частью наконечника. Вода в кристаллизаторах обновляется наполовину 1 раз в 7 —10 дней. Накопившийся осадок удаляется сифоном. Аэрация среды в кристаллизаторе не проводится.
Для токсикологических исследований используют дафний, начиная со второго поколения. Опыты проводят на синхронизированной культуре, на дафниях одного возраста, что снижает вариабельность исследований.
Для получения синхронизированной культуры 3 — 5 половозрелых самок рассаживают по одной в химические стаканы (100 мл воды). После появления первого помета у наиболее плодовитой самки молодь отбирается и помещается в 1 — 2-литровый кристаллизатор для дальнейшего культивирования. Молодь второго поколения из одного помета в возрасте 1 — 2 сут используют в опыте.
Хронический опыт с дафниями, длящийся до 30 сут, служит для глубокого, подробного исследования свойств природных, сточных вод и отдельных веществ.
Условия проведения хронических опытов аналогичны описанным выше острым опытам: постоянный температурный, световой режим, ежедневное внесение корма — водоросли хлорелла (600—700 тыс. кл./мл). Смена растворов производится 2—3 раза в неделю с сохранением соотношения 50 мл раствора на одну дафнию. Значение биологических характеристик дафний в токсикологических опытах сравнивается с контрольными.
При проведении опытов на поколениях придерживаются следующей схемы: молодь из первого помета, появившуюся у исходных особей в опытных и контрольных растворах, отсаживают по 10 шт. в стаканы емкостью 500 мл с соответствующими разведениями сточных вод или концентрациями исследуемых веществ. При наблюдении за размножением рачков учитывают время наступления половозрелости в днях, решетрируемое по моменту откладки яиц в выводковую камеру, время рождения первого помета с учетом выхода молоди из выводковой камеры, число пометов за срок наблюдения, общее количество родившейся молоди, абортивных яиц, мертворожденной и уродливой молоди.
Молодь просчитывают и удаляют. Продолжительность опытов с каждым поколением — 30 сут. Исследуется не менее трех поколений. Результаты записываются в табл. 29.1.
Таблица 29.1
Изменение биологических показателей у дафний

Дата	Длитель- ность, сут	Контроль
		исходные, поколение 1, 2 ит.д.
		КОЛ-ВО дафний	карапак сы	молодь	абортивные яйца	мертвые	эфип- пии
	1
	30
Итого

Продолжение табл.'29.1

Дата	Длительность, сут	В исследуемых образцах природных вод или с солями меди
		исходные, поколение 1, 2 ит.д.
		кол-во дафний	карапак сы	молодь	абортивные яйца	мертвые	эфип- пии
	1
	30
Итого

Общее количество народившейся жизнеспособной молоди от одной самки за 30 сут отражает величину реальной (фактической) плодовитости дафний.

Эта величина в конечном итоге определяет сохранность вида и имеет решающую роль при оценке токсичности воды.
Для наглядности строят графики выживаемости, плодовитости (по оси абсцисс откладывают время или поколения, а по оси ординат — величину показателя для контрольных и опытных растворов).
Принцип предложенного в лабораторной работе метода основан на изменении выживаемости и физиологического состояния дафний в среде с токсикантами.
Цель работы — экспресс-оценка качества воды, загрязненной солями меди с использованием в качестве тест-объектов дафний.
Оборудование, материалы и реактивы:
микроскоп МБС-10; колба с культурой водорослей; микрокомпрессор (для продувания воздуха в колбе с культурой водорослей); 12 стаканов химических на 0,2 л; кристаллизатор на 2—5,0 л для культивирования дафний; пипетка автоматическая на 1, 10 мл; раствор СиС12.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
L. Приготовить раствор СиС12в концентрации 10, 1, 01 ПДК (см. табл. 14.1). В 9 стаканов налить по 200 мл раствора в исследуемых концентрациях (каждая в трех повторностях) и посадить по 10 дафний. В оставшиеся 3 стакана поместить по 10 дафний в 200 мл водопроводной воды (контроль). В кратковременных опытах основным показателем токсичности среды является выживаемость рачков. Наблюдения за выживаемостью дафний проводят непрерывно в течение первого часа действия раствора, через каждые 15 мин в продолжение второго часа, затем через 24, 48 и 96 ч. Время гибели рачков отмечают по наступлению неподвижности (иммобилизации): дафнии лежат на дне стакана, плавательные движения отсутствуют и не возобновляются при покачи-
Таблица 29.2
Выживаемость дафний в образцах воды из природных источников (нгг.)

Продолжи- тельность экспозиции	Контроль	Образны воды из природного водоема
	повторности	повторности	повторности

Табли ца 29.3
Индикаторные реакции дафний на загрязнение

Животное

Индикаторные реакции

Дафнии

Усиление или угнетение двигательной активности; выбросы эмбрионов; интенсивные выделения, которые коагулируют, и рачки вместе с эмбрионами и молодью путаются в нитках выделений. Помутнение, изменение окраски, обесцвечивание; разложение жировых капель; неравномерное заполнение или пустой кишечник; забивание фильтрационного аппарата; гибель яиц в выводковой камере. Судорожные конвульсии, замедление движения антенн, гибель. Потеря у мертвых дафний пигмента. Хроническая реакция: измельчание, отрождение мертвой молоди, снижение выживаемости

вании стакана. Данные выживаемости рачков во времени записывают в табл. 29.2. В качестве дополнительных показателей у дафний в остром опыте можно учитывать физиологические показатели, приведенные в табл. 29.3.
Внимание! Оценка этих показателей у дафний, тестируемых в воде из природных источников, проводится по балльной системе (табл. 29.4). По табл. 29.5 можно приблизительно определить концентрацию Си в воде в миллиграммах на литр.
Таблица 29.4
Определение степени загрязнения водоема по состоянию дафний

Зона загрязнения	Индикационные изменения у дафний
1-я — сильное загрязнение (приближенная к источнику загрязнения)	Частичная гибель особей, особи держатся в природном слое, часть теряет активность, наблюдаются случаи «вертячки». Отмечается осадок на антеннах, забитые фильтрационные аппараты. Гибнущие особи имеют розовую диффузную окраску
2-я — среднее загрязнение	Повышение активности сменяется угнетением, дафнии периодически залегают на дно, особи имеют пустой кишечник, мутно-желтую окраску, сердцебиения ослаблены, отсутствуют жировые капли
3-я — слабое загрязнение (удаленная от источника)	Наличие повышенной активности у отдельных особей, у остальных — периоды активности сменяются нормальным состоянием; кишечник слабо наполнен

Реакции биотестов на присутствие токсикантов
Таблица 29.5

Концентрация Си, мг/л воды	Индикаторные изменения у гидробионтов
До 0,2	Личинки ручейников не строят домиков или их структура отличается от таковых у контрольных особей. У взрослых вылетающих насекомых отмечается недоразвитие крыльев, кровоизлияние в основании крыльев
0,25	Наблюдается обесцвечивание тела у молоди второго поколения дафний при их культивировании в этой воде
0,5	Обесцвечивание тела дафний, жировые капли отсутствуют
0,8	У личинок хирономид разрушается гемоглобин, и они приобретают зеленую окраску. Нарушается пищеварение и выпадает дистальная часть кишечника
Выше 0,8	Личинки комаров впадают в оцепенение, близкое к параличу. У дафний резко повышается активность и нарушается координация движений

Изменения перечисленных физиологических показателей нередко предшествуют гибели животных, что позволяет использовать их для ранней диагностики.
Внимание! Если гибель контрольных дафний в период испытаний превысит 10%, опыт повторяют заново. По результатам опытов определить среднюю (медианную) летальную концентрацию вещества (ЛКт), вызывающую гибель 50% подопытных животных за 96 ч (ЛК5о), концентрацию вещества, при которой гибнут все животные (ЛК100), пороговую концентрацию (минимально действующую), при которой организмы не гибнут (JIKq), и среднее (медианное) время выживания 50% особей (ЛВ5о). При обработке результатов эксперимента провести сравнение показателей подопытных и контрольных дафний. Определение достоверности отклонения от контроля осуществить стандартными методами вариационной статистики.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Брагинский Л. П. Визуально фиксируемые реакции пресноводных гид- робионтов как экспресс-индикаторы токсичности водной среды / Л. П. Брагинский, А. А. Игнатюк // Гидробиол. журн., 2005. — Т. 41. — № 4.
Исакова Е. Ф. Методы биотестирования с использованием дафнии / Е. Ф. Исакова, Л. В. Колосова // Методы биотестирования вод. — Черноголовка: Ин-т химической физики АН, 1988.
Мелехова О. П. Экспресс-метод биотестирования качества воды по метаболическому критерию / О. П. Мелехова [и др.]. — М.: РГОТУПС, 2000.
Методы биотестирования качества водной среды / под ред. О.Ф.Фи- ленко. — М.: Изд-во МГУ, 1989.
Методы изучения состояния окружающей среды: Практикум по экологии. — Вологда: Русь, 1996.
Методика определения токсичности воды по смертности и изменению плодовитости дафний. Федеральный реестр ФР.1.39.2001.00285. — М.: Акварос, 2001.
Пашков Е. В. Международные стандарты ИСО 14 000. Основы экологического управления / Е.В. Пашков [и др.]. — М.: Изд. стандартов, 1997.
Филенко О. Ф. Водная токсикология. — М.: Изд-во МГУ, 1988. — 154 с.
Флёров Б. А. Биотестирование с использованием цериодафний: Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90 / Б. А Флёров, Н.СЖмур. - М., 1991. 

Еще по теме Лабораторная работа №29. ПРОВЕДЕНИЕТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА ДАФНИЯХ (Лабораторная работа подготовлена О. П. Мелеховой и Е. И. Егоровой на основе методических рекомендаций О. Ф. Филенко):

1.   ГЛАВА 3 ЛАБОРАТОРНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ
2. 6.2. Исследование способности животных к символизации (на примере «счета») с помощью лабораторных тестов
3. Основы безопасности при работе со шмелями
4. 2.8. Исследование зачатков мышления у животных-неприматов в первой половине XX века. Работы Н. Майера и О. Келера
5. 3 ГИГИЕНА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
6. СВЕДЕНИЯ О ГЕЛЬМИНТОЗАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ
7. Лабораторно-полевые ульи для шмелей
8.   ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ТЕСТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРЕННИХ БОЛЕЗНЕЙ 
9. Организация оплодотворения самок в лабораторных условиях
10.   ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АППАРАТУРЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ  
11. АДЕНОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ОБЕЗЬЯН И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
12. ГЛАВА 19 ГИГИЕНА СОДЕРЖАНИЯ СОБАК, КОШЕК И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ