Лабораторная работа №5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО МИКРОБНОГО ЧИСЛА В ВОДОЕМЕ {Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)

В связи с тем что определение патогенных бактерий при биологическом анализе воды представляет собой непростую и трудоемкую задачу, в качестве критерия бактериологической загрязненности используют подсчет общего числа образующих колонии бактерий (Colony Forming Units — CFU) в 1 мл воды. Полученное значение называют общим микробным числом.
Пробы воды для микробиологического исследования отбирают с соблюдением правил стерильности в стерильную стеклянную посуду с притертыми или ватно-марлевыми пробками. В стоячих водоемах пробы отбирают с помощью батометров, погруженных на уровень 10 —15 см от дна, в проточных водоемах — около берега и в центре течения. При плановом санитарном контроле отбирают не менее 500 мл воды. Микробиологическое исследование выполняют не позднее 2 ч с момента взятия пробы (либо при условии хранения при температурах 1 — 5 °С не более 6 ч).
Выявление микроорганизмов и их учет можно произвести путем высева проб в простые жидкие и агаризованные питательные среды. Для учета некоторых гетеротрофных[††] сапротрофных[‡‡] бактерий используют мясопептонный агар (МПА). Обычно число сапротрофных микроорганизмов, выращенных на МПА, соответствует степени загрязненности воды органическими веществами и косвенно характеризует ее санитарное состояние. Для выделения бактерий и подсчета общего микробного числа в основном используют метод фильтрации через мембрану (рис. 5.1) или глубинным посевом.
Принцип предложного в лабораторной работе метода заключается в том, что пробы воды (объем зависит от типа водоема и степени его эвтрофикации) фильтруют через мембранные фильтры. Затем фильтры стерильно раскладывают на поверхность аГamp;- ризованной среды для проращивания осевших на них микроорга-

низмов. После инкубации подсчитывают количество колоний, выросших на поверхности мембранных фильтров.
Цель работы — определение общего микробного числа в водоеме, расположенном в рекреационной зоне города.
Оборудование, материалы и реактивы:
стерильные чашки Петри, стерильные мембранные фильтры (d = 0,45мкм); фильтровальный прибор Зейтца; водоструйный насос; мясопептонный агар (МПА); стерильный пинцет; 70 %-й спирт; спиртовка; термостат; стерильные колбы.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Фильтры стерилизуют кипячением в дистиллированной воде по 1 — 5 мин. Фильтры с дефектами отбрасывают. Сделать серию последовательных разведений (102—106) воды из водоема (в зависимости от предполагаемой степени загрязнения). По 10 мл воды из каждого разведения пропустить через мембранные фильтры, наложенные на предварительно профламби- рованную поверхность фильтровального прибора Зейтца, используя водоструйный насос. В результате на поверхности мембраны остаются все находящиеся в воде бактерии. Каждую пробу анализировать в 3 — 5-кратной повторности. Разлить по 20 мл МПА в чашки Петри. Мембранные фильтры с бактериями стерильным пинцетом поместить фильтратом на поверхность питательной среды в чашки Петри на 24 ч. Чашки перевернуть и инкубировать при температуре 30—37 °С в термостате.

Рис. 5.1. Схема учета микроорганизмов методом мембранных фильтров

По истечении времени инкубации подсчитать количество колоний микроорганизмов на поверхности питательного агара, которые можно наблюдать на чашках Петри (рис. 5.2). Подсчет следует провести на всех параллельных чашках и найти среднее значение.
Внимание! Такой метод анализа воды предполагает определение только общего числа колоний, образованных бактериями разных типов, поэтому по его результатам нельзя однозначно судить о присутствии в воде патогенных микроорганизмов. Однако высокое микробное число свидетельствует об общей бактериологической загрязненности воды и высокой вероятности наличия патогенных организмов (табл.

5.1). Численность клеток гетеротрофных микроорганизмов в 1 мл воды рассчитать по формуле А = т/ю, где N — число колоний на чашке, кл; Я — разведение, из которого произведен посев; 10 — пересчет на 1 мл.
Внимание! Посев можно провести глубинным методом. Для этого по 1 мл исследуемой воды из разведений 102—106 внести в чашки Петри, залить сверху расплавленным и охлажденным до 45—50 °С МПА, круговыми движениями по столу размешать посев. Дать застыть, перевернуть чашку и инкубировать в термостате 24 ч при 30—37 “С. Подсчет общего микробного числа сделать с учетом раз- ведений. После подсчета всех колоний на чашке их можно сгруппировать по культуральным признакам, сделать мазки, прокрасить по Граму для оценки морфологических характеристик и определить микроорганизмы до рода (или до вида).

Рис. 5.2. Рост гетеротрофных микроорганизмов на чашках Петри


Таблица 5.1
Классы качества воды природных водоемов по бактериальным показателям

Показатель	Классы качества воды
	предельно чистая	чистая	удовлетворительно чистая	загрязнен ная	грязная
Численность бактерий планктона, млн кл/мл	lt;0,3	0,3-1,5	1,6-5,0	5,1-11,0	gt;11,0
Численность гетеротрофных бактерий, тыс. кл/мл	lt;0,1	О т о	1,1-5,0	О о 7 УГ\	gt; 10,0
Численность бактерий группы кишечной палочки, тыс. кл/мл	lt;0,003	0,003 - 2,0	2,1-10,0	11,0-100	gt;100

По табл. 5.1 определить, к какому классу качества относится вода из тестируемого водоема, находящегося в рекреационной зоне города.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Стерилизация посуды и сред
В микробиологии стерилизация, или обеспложивание (от лат. sterilis — бесплодный), означает полное уничтожение вегетативных клеток, спор и цист микроорганизмов. Существует несколько способов стерилизации. Прокаливание, или фламбирование в пламени горелки (иглы, петли, горлышки колб, пробирок). Сухим жаром стеклянную посуду в суховоздушных стерилизаторах в течение 2 ч при 170 °С. Перед стерилизацией стеклянные пробирки и колбы закрывают ватными пробками, отверстия оборачивают бумагой. Насыщенным паром под давлением питательные среды в автоклаве при температуре 120 "С, давлении 1 атм в течение 20 мин.
Приготовление питательных сред
Наиболее удобны в работе готовые сухие питательные среды, разведение которых указано на этикетке. Однако мясопептонный

агар (МПА) легко приготовить в лабораторных условиях. Для этого бульонные говяжьи кубики развести в дистиллированной воде. Внести в среду 1 % пептона и 2 % агар-агара. Смесь настоять 1 ч, затем нагреть на водяной бане до полного растворения агара. МПА стерилизовать автоклавированием в колбах или пробирках.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Гигиенические требования к охране поверхностных вод. — СанПиН 2.1.5.980-00.
Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений / под ред. В. А. Абакумова. — М.: Госком- гидромед, 1983.
Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды. Методические указания. —А1.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001.
Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З.Теппер [и др.]. — М.: Колос, 1993. 

Еще по теме Лабораторная работа №5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО МИКРОБНОГО ЧИСЛА В ВОДОЕМЕ {Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой):

1. 3 ГИГИЕНА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
2. СВЕДЕНИЯ О ГЕЛЬМИНТОЗАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ
3.   ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ТЕСТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРЕННИХ БОЛЕЗНЕЙ 
4. Лабораторно-полевые ульи для шмелей
5. Организация оплодотворения самок в лабораторных условиях
6.   ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АППАРАТУРЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ  
7. АДЕНОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ОБЕЗЬЯН И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
8.   ГЛАВА 3 ЛАБОРАТОРНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ
9. ГЛАВА 19 ГИГИЕНА СОДЕРЖАНИЯ СОБАК, КОШЕК И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
10.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИСЛОТНОГО ЧИСЛА ЖИРА (ГОСТ 13496.18-85)