Методы выявления резистентности гельминтов к антигельминтикам

Резистентность гельминтов к препаратам возникает при длительном применении (5 лет и более) антигельминтиков (а кокци- диостатиков - 12 мес и более) со сходной химической формулой и механизмом действия (R.K. Prichard, 1980; М.А. Taylor, K.R. Hunt, 1989).

В основе возникновения устойчивости у отдельных штаммов паразитов лежит генетический механизм селекции (J.D. Kelly et al., 1975; D. Duwel, 1987).

До использования препарата с новой химической структурой в популяции паразитов уже присутствуют особи, имеющие к нему гены резистентности, но в малом количестве по сравнению с чувствительными особями. Систематическое воздействие химических соединений приводит к их селекции. В результате чувствительные особи погибают, а резистентные, выжившие после лечения, остаются. Последние имеют гены резистентности, которые они передают следующему поколению. Скорость развития резистентности зависит от генетической вариации в популяции паразитов и кратности применения препаратов (R.K. Prichard et al., 1980).

При комплексном изменении различных генов (мутации) возникает перекрестная резистентность к различным классам препаратов, что чаще проявляется при применении комбинированных средств.

Антигельминтную резистентность чаще всего отмечают у стронгилят пищеварительного тракта жвачных (H.

В России первым вопросами резистентности гельминтов к препаратам начал заниматься A.B. Малахов (1982). Им впервые у кур выявлены резистентные к пиперазину штаммы A. galli. В Казахстане у овец выявлены резистентные к фенотиазину штаммы

8. contortus (P.C. Кармалиев и др., 1992). В Калмыкии установлены резистентные штаммы нематодирусов у овец к действию бен- зимидазолкарбаматов (И.А. Архипов и др., 2002).

Методы выявления антигельминтной резистентности необходимы для коррекции практического применения препаратов с одинаковой химической структурой в условиях их частого использования.

Для тестирования антигельминтной резистентности применяют методы «in vitro» и «in vivo» (М.А. Taylor, K.R. Hunt, 1989).

Методы «in vitro»

Биологические тесты. Тест вылупления личинок из яиц гельминтов (P.C. Кармалиев, 1991). Технически наиболее просто выполним. Яйца гельминтов (стронгилят) культивируют в растворах с различными концентрациями антигельминтика при температуре 27 °С в течение 24 ч. Вылупление личинок из яиц гельминтов резистентного штамма происходит при повышенных концентрациях препарата по сравнению с чувствительным штаммом.

Концентрация лекарственного вещества, необходимая для гибели 50 % яиц (ЛК50), является количественным показателем чувствительности данного штамма гельминтов к этому препарату. Величину фактора резистентности (ФР) определяют соотношением ЛД5о резистентного штамма к тестируемому. Если ФР больше 1, то тестируемый штамм гельминтов является чувствительным к данному антигельминтику, если равен 1 - устойчивым.

Для того, чтобы результаты были точными, необходимо брать культуру яиц на начальной стадии эмбриогенеза, так как препараты из группы бензимидазолов ингибируют развитие зародыша на ранней стадии, а далее он менее чувствителен к ним.

Тест паралича личинок. Этот тест используют для антигельминтиков, обладающих паралитическим действием. Инвазионных личинок нематод выдерживают в растворах с различной концентрацией антигельминтика при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем личинок исследуют под микроскопом и классифицируют как нормальные или парализованные. Чувствительность гельминтов к антигельминтику выражается в ЛК5о, вызывающей паралич 50 % личинок этого штамма.

Для определения антигельминтной резистентности паразитических нематод в условиях «ш vitro» в «Тесте паралича личинок» можно использовать специальное устройство «Звездочка», разработанное В.Ф. Никитиным и Павласеком. Предварительно инвазионных личинок нематод получают из фекалий животных при помощи этого устройства. Для постановки теста готовится раствор антигельминтика в разной концентрации. Затем в одну чашку Петри вносят раствор антигельминтика, а в другую - равный объем воды (контроль). Во все чашки вносят по 2 мл взвеси инвазионных личинок гельминтов условно резистентных и чувствительных штаммов в концентрации не менее 100 личинок в 2 мл. Личинок выдерживают в растворах антигельминтика 24 ч при комнатной температуре. Подсчитывают все 100 личинок, дифференцируют их как жизнеспособные (подвижные) и парализованные (без заметного движения в течение 5 с) и устанавливают летальную концентрацию (ЛК50) препарата, которая вызывает паралич у 50 % личинок гельминтов.

Кроме того, можно использовать и другие тесты:

• тест развития личинок до инвазионной стадии;
• тест развития инвазионных личинок до половозрелых особей;
• тест паралича личинок с использованием микроизмерителя подвижности;
• тест паралича личинок с использованием эзерина;
• тубулин связывающий тест.

Биохимические тесты.

Основываясь на том, что у резистентных гельминтов активность неспецифических эстераз и ацетилхолинэстеразы выше, чем у чувствительных, разработаны тесты определения чувствительности к антигельминтикам по уровням активности этих ферментов:

• тест уровня активности фумаратредуктазы;
• тест уровня активности малатдегидрогеназы;
• тест уровня активности неспецифических эстераз;
• тест уровня активности ацетилхолинэстеразы.

С их помощью определяют резистентность гельминтов к бен- зимидазолам, левамизолу, авермектинам и другим препаратам.

Методы «ш vivo»

Критический тест по снижению количества яиц в фекалиях. Эффективность антигельминтика оценивают, сравнивая количество яиц гельминтов в фекалиях до и после лечения опытных животных.

Контрольный тест. Оценку эффективности препаратов проводят через 10—14 сут после их применения, используя метод гельминтологического вскрытия животных и подсчета количества гельминтов от леченых и контрольных животных.