ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРОФЛОРЫ РУБЦА  

Реактив: 0,03%-ный раствор метиленового синего.

Оборудование: водяная баня; пробирки или химические стаканчики; стеклянные палочки; секундомер или часы.

Ход определения.

38. °С и контролируют время обесцвечивания красящего вещества, сравнивая опытную пробу с контрольной.

У здорового крупного рогатого скота при смешанном типе кормления обесцвечивание наступает за 3 мин. Если же обесцвечивание продолжается 15—17 мин, необходимо обратить внимание на кормление животных (качество корма и режим кормления). Увеличение времени обесцвечивания раствора метиленового синего до 30 мин и более свидетельствует о заболевании преджелудков.

Проба со сбраживанием глюкозы. Принцип. Легкоперевари- мые углеводы, поступающие с кормом в рубец, активно ферментируются микрофлорой до ЛЖК и газов (углекислый, метан, водород). Добавляя глюкозу к содержимому рубца (in vitro), фиксируют активность газообразования и таким образом делают выводы о ферментативной способности микроорганизмов.

Реактив: свежеприготовленный 16%-ный раствор глюкозы.

Оборудование: сахарометр или градуированные пробирки; термостат.

Ход определения. В сахарометре или градуированной пробирке смешивают 10 мл свежего содержимого рубца с 0,5 мл 16%-ного слегка подогретого раствора глюкозы и-ставят в термостат при температуре 38 °С.

В содержимом рубца здорового крупного рогатого скота при сбраживании глюкозы газовая прослойка толщиной 1 см образуется в течение 30 мин, а через 60 мин она достигает 2 см. При инактивации микрофлоры (ацидоз, алкалоз) количество образовавшихся газов незначительно или их нет совсем. При тимпании рубца газообразование значительно возрастает.

Проба с восстановлением нитратов. Принцип. Внесение калия нитрата в содержимое рубца (in vitro) вызывает его восстановление микроорганизмами и использование азота, характеризующееся исчезновением красного цвета.

Реактивы: 0,025%-ный раствор калия нитрата (KN03);

реактив 1: 2,0 мл концентрированной серной кислоты смешивают с 200 мл 30%-ного раствора уксусной кислоты;

реактив 2\ 0,6 мл а-нафтилина, 16,0 мл концентрированной уксусной кислоты смешивают со 140 мл дистиллированной воды.

Оборудование: водяная баня; пробирки; пластина с ячейками.

Ход определения. ВЗ пробирки наливают по 10 мл содержимого рубца. В первую пробирку вносят 0,2 мл, во вторую 0,5 мл и при необходимости в третью 0,7 мл 0,025%-ного раствора калия нитрата. Пробирки ставят в водяную баню при температуре 39 °С. Через 5 мин из каждой пробирки берут по 1 капле смеси и наносят на пластинку с ячейками. Затем добавляют по 2 капли реактивов 1 и 2. Если восстановление нитратов не наступило, то смесь окрашивается в красный цвет. В случае расщепления калия нитрата микрофлорой в течение 5 мин окрашивание не появляется. При появлении красного цвета продолжают контролировать время обесцвечивания поминутно.

В содержимом рубца здоровых животных KNO3 восстанавливается через 5—10 мин в первой пробирке и через 20 и 30 мин соответственно во второй и третьей. При нарушении ферментативной активности микрофлоры (ацидоз, алкалоз, атонии, гипотонии) время восстановления затягивается или же восстановления вообще не происходит.

Определение целлюлолитической активности микрофлоры. Расщепление грубого корма у жвачных происходит ферментами цел- люлолитических микроорганизмов, которые заселяют рубец во время поедания первых порций сена (примерно в двухнедельном возрасте).

Пр и н ц и п базируется на способности целлюлолитической микрофлоры переваривать хлопчатобумажную нить (in vitro).

Реактив: 16%-ный раствор глюкозы.

Оборудование: термостат; пробирки; стеклянный шарик; натуральная хлопчатобумажная нить № 10 (искусственную или по- лусинтетическую не используют).

Ход определения. В пробирке смешивают 10 мл свежевзя- того содержимого рубца и 0,3 мл 16%-ного раствора глюкозы. К концу хлопчатобумажной нити привязывают стеклянный шарик и опускают на дно пробирки с содержимым рубца. Противоположный конец нити фиксируют вокруг внешнего края пробирки. Пробу помещают в термостат при 39 °С и через 12 ч проводят первый контроль. Содержимое рубца переваривает нить в течение 96 ч. Если за это время переваривание не произошло, целлюлолитическая активность считается отрицательной.

Определение амилолитической активности содержимого рубца. Определение амилолитической активности содержимого рубца базируется на принципе расщепления крахмала микробной амилазой; фотоэлектроколориметрический анализ проводится по цветной реакции крахмала и йода.

Реактивы: 6,25%-ный раствор крахмала (готовится непосредственно перед использованием). В колбочку на 250 мл отвешивают 6,25 г водорастворимого крахмала и доливают 80 мл дистиллированной воды. После образования суспензии крахмала колбочку 10 мин выдерживают в кипящей водяной бане (до полного растворения крахмала), часто встряхивая. Раствор крахмала, охлажденный до комнатной температуры, переносят в мерную колбочку на 100 мл и доводят объем кипяченой дистиллированной водой до метки;

фосфатный буфер, pH 6,8;

2. н. раствор хлористоводородной кислоты (НС1);

раствор калия йод-йодистого.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; мерные колбы на 50 мл.

Ход определения. В пробирке смешивают 1,6 мл 6,25%-ного раствора крахмального субстрата с 7,4 мл фосфатного буфера. После 10-минутного нагревания пробирки в водяной бане при 40 °С добавляют 1 мл жидкости рубца, процеженной через 2 слоя марли. Содержимое пробирки тщательно взбалтывают и сразу же пипеткой переносят 0,5 мл этой жидкости в мерную колбу на 50 мл с 2 мл 2 н. раствора НС1 для прекращения действия микробных ферментов. В колбу добавляют 2 мл раствора калия йод-йодистого и дистиллированной водой доводят объем до 50 мл (проба до инкубации). После этого пробирку выдерживают 1 ч в водяной бане при температуре 40 °С, периодически (через 10—15 мин) перемешивая содержимое пробирки встряхиванием. По завершении инкубации из пробирки отбирают пробу 0,5 мл и переносят в мерную колбочку на 50 мл с 2 мл 2 н. раствора НС1. Добавляют 2 мл калия йод-йодистого и дистиллированную воду до метки (проба после инкубации).

Полученные растворы проб до инкубации и через 1 ч после нее исследуют на ФЭКе в кюветах на 5 мм при красном светофильтре (620 нм) против дистиллированной воды.

Расчет. По калибровочной кривой определяют количество крахмала (мг) в растворах до инкубации и после нее. Разница между этими показателями дает количество крахмала, расщепленного микробной амилазой за 1 ч инкубации. Амилолитическая активность выражается формулой

х=(А- В)- 20,

где х — количество крахмала, расщепленного 1 мл содержимого рубца за 1 ч, мг; А — количество крахмала в растворе до инкубации, мг; В — количество крахмала после инкубации, мг; 20 — коэффициент перерасчета на 1 мл содержимого рубца.